miRNA-21過表達對乳鼠星形膠質細胞凋亡及Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的影響

朱睿明，邢方嵐，張起順，趙 俊

河南大學淮河醫院康復醫學科 河南開封 475000

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴重的中樞神經系統疾病，近些年的發病率呈現上升趨勢[1]。星形膠質細胞(astrocytes，AS)是一種在哺乳動物腦組織廣泛存在的膠質細胞，不僅可調控神經元的生長、分化及凋亡，還可通過分泌營養因子、多種激素等維持神經元的結構及功能，且在腦缺血、中樞神經系統疾病等的發生發展過程中有重要作用[2-3]。有研究[4-6]表明AS具有保護神經元、抑制損傷處炎癥、建立軸突聯系等功能，同時可能介導嗅鞘細胞在脊髓修復中的作用，這為SCI修復提供了新的治療策略。miRNA(miR)在神經系統疾病及神經系統的發育、分化等過程中發揮重要作用，其中miR-21是在人類組織及細胞中發現較早、存在較為廣泛的miR。有研究[7]顯示，miR-21可參與缺氧缺血性腦損傷后AS活性改變，發揮增殖促進及凋亡抑制作用；miR-21在鼠AS中的過度表達可減弱SCI的肥大反應[8]。本研究旨在觀察miR-21過表達對過氧化氫(H2O2)誘導的脊髓AS凋亡的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料新生SPF級1～3 d的SD乳鼠2只，體重3～5 g。FBS、DMEM培養基均購自美國Gibco公司，miR-21 mimics購自美國Dharmacon公司，MTT購自美國Sigma公司，Trizol、反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD公司，β-catenin、c-myc和Bax抗體及HRP標記的二抗均購自美國Abcam公司，酶標儀購自美國Bio-Rad公司，實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2鼠脊髓AS的培養無菌條件下剪開乳鼠背部皮膚及脊柱，剪斷脊髓兩側的神經根，取出脊髓放入加有PBS的培養皿內，眼科剪剝離血管和脊膜，PBS沖洗，剪碎后離心，于37 ℃水浴箱中使用胰蛋白酶消化15 min，離心，去上清，加入含體積分數15%FBS的DMEM培養基，混勻，重懸后過200目濾篩，以107～109個/L的密度轉移至含體積分數15%FBS的DMEM培養基的培養瓶中，于體積分數5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中孵育1 h，將未貼壁的細胞懸液取出，以1.0×106個/mL的密度接種于培養皿，置于培養箱內培養，2～3 d換液一次，8～9 d細胞達90%融合時，于37 ℃、260 r/min振蕩培養2 h以除去小膠質細胞，培養箱內放置1 h，200 r/min離心，37 ℃振蕩18 h以除去少突膠質細胞，PBS洗滌，換液，1 d后胰蛋白酶消化傳代。后續實驗選擇生長狀態良好的第3代細胞。

1.3AS損傷模型的建立以0(對照)、100、200、400、600、800 μmol/L的H2O2處理生長狀態良好的第3代AS，24 h后，加入20 μL的MTT溶液，孵育4 h后棄上清，每孔中加入DMSO溶液150 μL，振蕩10 min，于490 nm處用酶標儀測定吸光度(A)值，以此反映細胞活力和存活的數量。生長抑制率(IR)=(1-處理組A/對照組A)×100%。取IR接近50%的H2O2濃度為建立AS損傷模型的濃度。

1.4實驗分組及處理實驗分為3個處理組，空白對照組(細胞未做任何特殊處理)、H2O2組(400 μmol/L的H2O2處理AS 24 h)和miR-21+H2O2組(miR-21 mimics轉染AS 24 h后用400 μmol/L的H2O2處理細胞24 h)。其中miR-21的轉染參照美國Invitrogen公司的LipofectamineTM2000轉染說明。

1.5qRT-PCR檢測miR-21的表達收集3組細胞，Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板。每組設置3個復孔，以U6作為內參基因進行PCR。反應體系：SYBR Green qPCR Mix(2×)10 μL，cDNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，RNase-free ddH2O 6.4 μL。反應條件：首次94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s， 70 ℃ 40 s，共40個循環。其中miR-21及U6引物設計及合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。依據所得Ct均值，采用2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達量。實驗重復3次。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡率收集上述3組細胞，預冷PBS洗滌，500 μL Binding buffer 懸浮細胞，分別加入AnnexinV-FITC和PI各5 μL，室溫避光反應20 min，上機前再加入Binding buffer 300 μL，1 h內上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.7Westernblot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達加入適量裂解液提取3組細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，每孔道上樣40 μg蛋白，經100 g/L SDS-PAGE分離后電轉至PVDF膜，用50 g/L脫脂奶粉溶液封閉2 h，加入均按1∶500稀釋的β-catenin、c-myc和Bax抗體，4 ℃搖床孵育過夜，洗膜，加按1∶2 000稀釋的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL法顯影，Quantity one 4.0軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白和GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.8統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。采用單因素方差分析比較不同濃度H2O2處理組AS生長抑制率，3組AS細胞間miR-21相對表達量、凋亡率以及β-catenin、c-myc和Bax蛋白表達的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1H2O2對AS的毒性作用100、200、400、600、800 μmol/L的H2O2對AS的抑制率分別為(25.47±1.32)%、(36.42±1.21)%、(50.17±1.03)%、(58.26±2.13)%、(66.13±2.24)%，隨著濃度增加，H2O2對AS的抑制率增大(F=766.124，P<0.001)。400 μmol/L的H2O2可抑制約一半的細胞增殖，因此后續實驗選擇400 μmol/L為建立AS損傷模型的濃度。

2.2 3組ASmiR-21表達及凋亡率的比較結果見表1。與空白對照組比較，H2O2處理可降低miR-21的表達，誘導細胞凋亡；而轉染miR-21 mimics后miR-21表達升高，細胞凋亡受抑。

表1 3組細胞miR-21的表達和凋亡率比較(n=3)

*：與空白對照組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

2.3 3組AS細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達的比較H2O2組β-catenin和c-myc的表達均低于空白對照組，Bax蛋白的表達高于空白對照組；而miR-21+H2O2組β-catenin和c-myc均高于H2O2組，Bax蛋白表達低于H2O2組。見圖1、表2。

圖1 3組細胞Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白的表達

組別β-cateninc-mycBax空白對照組0.756±0.0660.387±0.0410.061±0.007H2O2組0.152±0.016*0.126±0.014*0.289±0.028*miR-21+H2O2組0.513±0.046#0.311±0.032#0.173±0.021#F123.55555.90691.818P<0.001<0.001<0.001

*：與空白對照組比較，P<0.05；#:與H2O2組比較，P<0.05

3 討論

AS在脊髓內含量最高，分布在脊髓的各個區域。有研究[9-10]顯示，缺血性損傷、氧化應激等可引起AS凋亡，且AS的凋亡可能成為帕金森癥、腦缺血等神經退行性疾病的發病機制。氧化應激是細胞內氧化平衡狀態失衡現象，H2O2是人體內的主要活性氧(ROS)，有研究[11]證實，ROS可誘導神經元凋亡或壞死，參與神經元病變性疾病的發生及發展。也有研究[12-13]證實，H2O2可引起AS凋亡，而降低氧化損傷可減少AS凋亡，對于SCI治療具有重要意義。研究[14-15]顯示，miR在脊髓可塑性、發育及損傷后的病理改變中發揮重要作用，一些miR可能成為SCI后有效的干預靶點。miR-21是miR家族成員之一。有研究[8]顯示，miR-21在鼠AS中的過度表達可減弱SCI的肥大反應。本研究首先使用100～800 μmol/L的H2O2處理AS，發現400 μmol/L的H2O2可抑制約一半的AS增殖，因此選擇此濃度作為建立AS損傷模型的濃度。此外發現，H2O2可抑制AS中miR-21表達，而轉染miR-21 mimics后AS中miR-21表達升高，過表達miR-21 可降低由H2O2誘導的AS凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路是經典信號途徑，在細胞中廣泛存在，參與細胞生長、分化、凋亡、能量代謝等過程的調控，在心血管疾病、癌癥、神經中樞系統疾病等發生過程中有重要作用[16-18]。有研究[4]表明，Wnt/β-catenin信號通路對AS生長具有調控作用。Wnt/β-catenin信號的激活可抑制AS的凋亡[19]。Bcl-2家族是主要的凋亡調控蛋白，包括Bcl-2、Bax等，Bax主要促進細胞凋亡。研究[5，20]顯示，在腦缺血再灌注大鼠海馬中Bax表達下調，H2O2誘導的AS中Bax表達上調。本研究結果顯示，H2O2可下調AS中Wnt/β-catenin信號通路關鍵分子β-catenin和c-myc表達，上調Bax表達；而過表達miR-21可上調β-catenin和c-myc表達，下調Bax表達；提示Wnt/β-catenin信號通路的激活可部分逆轉H2O2對AS的損傷作用。

綜上所述，過表達miR-21可降低AS凋亡，機制可能與Wnt/β-catenin信號通路的激活有關。該研究可能為SCI的治療提供一定的理論依據。后續將進一步探討miR-21對AS其他生物學特性的影響。