上調Cdr1as表達對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的影響

張 杰 ，賈麗萍，周 輝，劉 亮，銀鵬飛，陳文強 ，蘇 興

1)北大醫療魯中醫院心血管內科 山東淄博 255400 2)北京大學國際醫院心內科 北京102200 3)山東大學齊魯醫院心內科 濟南 250012

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心內科常見的心血管疾病，發病率呈年輕化和上升趨勢[1]。冠狀動脈急性和持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死是死亡的重要原因。心肌細胞凋亡是心肌梗死區和非梗死區發生的重要生理病理現象，研究心肌細胞凋亡的機制，尋找有效的分子靶點已逐漸成為研究熱點[2-3]。環狀RNA是一類特殊的非編碼RNA，含有能夠與microRNA結合的位點，能夠以海綿分子的形式解除microRNA對靶基因的調控，從而參與癌癥、神經系統疾病和心血管疾病的發生發展[4-6]。小腦變性相關蛋白1的反義轉錄物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，Cdr1as)是研究較多的環狀RNA，有研究[7]發現AMI患者血液中Cdr1as 水平明顯升高，Cdr1as可通過介導miR-7a調節靶基因的表達，促發心肌梗死。目前，關于Cdr1as促進心肌梗死的研究資料還較少，其具體的作用機制尚未明確。因此，本研究通過建立AMI大鼠模型，觀察Cdr1as在心肌組織中的表達情況，探討上調其表達誘導心肌細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料42只健康雄性SD大鼠，8周齡，體重220～280 g，購于吉林大學基礎醫學院動物實驗中心。pcDNA和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司， pcDNA-Cdr1as質粒購于丹麥奧胡斯大學。GAPDH抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體和羊抗鼠IgG-HRP購于美國Cell signaling公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒和RIPA蛋白裂解液均購于上海碧云天公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒購于武漢博士德公司，反轉錄試劑盒購于大連TaKaRa公司。心臟彩超儀購于美國ATL公司，酶標儀購于美國PerkinEImer公司，實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司，顯微鏡購于日本Olympus公司，紫外分光光度計購于美國Nanodrop公司，凝膠成像系統購于美國Bio-Rad公司。PCR引物購于上海吉瑪公司。

1.2AMI大鼠模型的建立和實驗分組選取適應性較好的SD大鼠32只，以體積分數10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，固定大鼠，將胸前區和頸部毛發剔除，并以碘伏消毒。在暴露的頸部器官處做長為1 cm的切口，連接呼吸機。呼吸機參數設為7～8 mL潮氣量，120 次/min呼吸頻率，1∶2呼吸時間比。在胸骨左緣第4肋間處剪開皮膚，暴露心臟。顯微鏡下結扎冠狀動脈左前降支(位于左心耳和肺動脈圓錐間)。心電圖記錄儀觀察：當ST段抬高、心率變慢和左心室發白時，表明AMI模型制備成功。將最終構建成功的30只大鼠模型隨機分為模型組、空質粒組和Cdr1as組，每組10只，分別于術前12 h心肌內注射等量生理鹽水、pcDNA溶液、pcDNA-Cdr1as溶液。另10只大鼠作為假手術組，只行冠狀動脈左前降支穿線而不做結扎，術前12 h心肌內注射等量生理鹽水。術后1周處死大鼠，取心肌組織儲存于溫度為-80 ℃冰箱中備用。

1.3心臟功能相關指標的檢測和心肌梗死面積的測定①心臟功能檢測：在處死大鼠前，對大鼠做心臟彩超，檢測左室收縮末期內徑(LVDs)、左室舒張末期內徑(LVDd)、左室長軸縮短分數(FS)和左室射血分數(LVEF)等指標。②心肌梗死面積測定：取適量心肌組織，2 mm厚切片，以TTC磷酸緩沖液染色20 min。染成紅色的為正常心肌組織，染成白色的為梗死心肌組織。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析。心肌梗死面積=白色區域面積/(白色+紅色)區域面積×100%。

1.4心肌組織中Cdr1as的qRT-PCR檢測每只大鼠均取1 g心肌組織，加入Trizol試劑提取總RNA，并采用紫外分光光度計測定純度，再按照反轉錄試劑盒說明書操作，合成cDNA。Cdr1as上下游引物分別為5’-GTGTCTCCAGTGTATCGGCG-3’和5’-TACTGGCACCACTGGAAACC-3’，內參GAPDH上下游引物分別為5’-GACATGCCGCCTG GAGAAAC-3’和5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。 PCR反應體系20 μL：SYBR Green 10 μL、 cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL，DEPC水7 μL。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸60 s，35個循環；72 ℃總延伸35 min。

1.5心肌細胞凋亡的TUNEL法檢測取大鼠心肌組織，5 μm厚切片，抗原修復、脫蠟處理后，用PBST溶液洗滌5 min×3次，再按照TUNEL試劑盒說明書操作。在200倍顯微鏡下選取梗死區域5個視野，統計凋亡細胞數和總細胞數，以兩者比值的百分數表示心肌細胞凋亡指數。

1.6心肌組織中Caspase-3活性的檢測嚴格參照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作，檢測大鼠心肌組織中Caspase-3活性。其中，酶標儀檢測波長為405 nm。

1.7心肌組織中Bax和Bcl-2蛋白的Westernblot法檢測取適量心肌組織，剪碎后以勻漿器制成勻漿，加入裂解液提取總蛋白，并采用BCA蛋白濃度定量試劑盒檢測總蛋白濃度。蛋白經沸水浴變性后，上樣至12 g/L SDS-PAGE凝膠中分離，再經轉膜、封閉處理后，加入1∶1 000稀釋的一抗溶液(4 ℃過夜)和1∶2 000稀釋的二抗溶液(37 ℃孵育2 h)。經曝光液顯影后，以凝膠成像系統掃描，Quantity One 軟件分析目的蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.8統計學處理采用SPSS21.0進行統計學分析，4組間各指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組大鼠心肌組織中Cdr1as表達水平的比較假手術組、模型組、空載體組和Cdr1as組心肌組織中Cdr1as表達水平分別為(1.02±0.12)、(2.83±0.52)、(2.92±0.45)和(5.98±0.61)，4組比較差異有統計學意義(F=29.090，P<0.001)。與假手術組相比，模型組、空載體組和Cdr1as組Cdr1as表達水平升高(P<0.05)，而Cdr1as組的表達水平高于模型組、空載體組(P<0.05)。

2.2 4組大鼠心臟功能及心肌梗死面積的比較結果見表1。與假手術組相比，模型組、空載體組和Cdr1as組LVDs、LVDd(P<0.05)，而LVEF和FS明顯降低(P<0.05)；而Cdr1as組心臟功能指標變化幅度較模型組、空載體組更為明顯(P<0.05)。Cdr1as組梗死面積大于模型組、空載體組(P<0.05)。

表1 4組大鼠心臟功能和心肌梗死面積的比較

*：與假手術組相比，P<0.05；#：與模型組和空載體組相比，P<0.05

2.3 4組大鼠心肌細胞凋亡指數和心肌組織中Caspase-3活性的比較見圖1和表2。與假手術組相比，模型組、空載體組和Cdr1as組心肌細胞凋亡指數和Capase-3活性均升高，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達升高(P<0.05)；Cdr1as組較空載體組和Cdr1as組的變化更為顯著(P<0.05)。

圖1 Western blot檢測各組心肌組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達

組別n凋亡指數/%Capase-3活性/(U/mg)Bcl-2Bax假手術組102.56±0.320.82±0.060.91±0.060.36±0.02模型組1032.25±4.18*6.75±0.55*0.39±0.02*0.65±0.03*空載體組1033.08±2.85*6.84±0.62*0.42±0.03*0.68±0.05*Cdr1as組1050.62±5.22*#8.68±0.49*#0.16±0.01*#0.95±0.08*#F90.065150.767238.88068.471P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：與假手術組相比，P<0.05；#：與模型組和空載體組相比，P<0.05

3 討論

Cdr1as位于人染色體Xq27.1，具有非線性結構、高表達性和穩定性強等特點，因其具有74個miR-7結合位點，能夠競爭性抑制miR-7活性，故又被稱為miR-7的環狀RNA海綿(ciRS-7)。Li等[8]在帕金森病細胞模型中發現，miR-7能夠通過降低Caspase-3活性和調控Bax、SIRT2靶點，抑制神經元的凋亡；Xiong等[9]指出，miR-7可靶向作用于Bcl-2，抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖，促進其凋亡。Cdr1as與多種腫瘤的發生發展關系密切。結直腸癌組織中Cdr1as的表達明顯高于正常黏膜組織，與患者預后不良相關[10]；C作用于dr1as還是肝細胞癌肝微血管侵襲的危險因素[11]。此外，Cdr1as能夠降低胰島細胞中miR-7的表達，影響胰島β細胞的活性，參與糖尿病的發生[12]。心肌細胞凋亡是心力衰竭、心肌重塑和心肌重構等發生的重要內在機制。近年來研究[7]顯示，Cdr1as在AMI患者中的表達水平明顯升高。鑒于Cdr1as與miR-7的調控關系，我們推測Cdr1as可能通過間接調控心肌細胞凋亡參與AMI的進展。因此了解和研究Cdr1as表達與心肌細胞凋亡的關系，對AMI的治療具有重要意義。

細胞凋亡是一個受多種基因共同調控的過程，Caspase-3是凋亡的效應分子和執行者，可通過激活核酸內切酶使DNA降解斷裂，導致細胞凋亡；Bcl-2和Bax是學術界公認的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，兩者結合可形成異二聚體，將凋亡信號傳遞到Caspase-3，引起細胞凋亡。大量研究[13-14]顯示，心肌細胞凋亡往往伴隨著Caspase-3活性和Bax表達的升高，以及Bcl-2表達的下降。本研究采用冠狀動脈左前降支結扎的方法構建AMI大鼠模型，通過檢測大鼠心臟功能指標LVDs、LVDd、LVEF和FS等和心肌梗死面積，證實模型構建成功。qRT-PCR檢測發現，通過心肌內局部注射pcDNA-Cdr1as質粒，成功上調了Cdr1as組大鼠心肌組織中Cdr1as的表達。Cdr1as組梗死面積較模型組和空質粒組顯著增加，心肌細胞凋亡指數顯著升高，Caspase-3活性和Bax表達升高，Bcl-2表達下降，提示上調Cdr1as表達可誘導心肌細胞凋亡，與Weng等[10]的研究結果一致。

綜上所述，鑒于Cdr1as與miR-7的調控關系，Cdr1as可能通過間接調控Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達，誘導心肌細胞凋亡，促進心肌梗死的發生發展。