miR-101對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及KIF14蛋白表達(dá)的影響

劉繼攀，孫 偉，趙學(xué)榮，李炳茂，王成君

衡水市哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院(衡水市人民醫(yī)院)普外二科 河北衡水053000

microRNA是廣泛存在于真核生物體中的微小RNA，具有高度保守性，不含開(kāi)放閱讀框，可調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]。miR-101-3p(miR-101)是一種與腫瘤發(fā)生有關(guān)的miRNA，其可以調(diào)控原癌基因的表達(dá)，影響多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。驅(qū)動(dòng)蛋白家族蛋白14(kinesin family member 14,KIF14)是一類(lèi)較為保守的微管依賴(lài)型馬達(dá)蛋白，具有ATP酶活性，參與染色體分離、小泡運(yùn)輸、胞質(zhì)分裂等生命活動(dòng)；其在宮頸癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等組織中表達(dá)上調(diào)，并且參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡過(guò)程[4-5]。我們根據(jù)靶基因預(yù)測(cè)庫(kù)(TargetScan、The miRBase、PicTar)預(yù)測(cè),miR-101能夠與KIF14 的3’UTR結(jié)合，提示KIF14 有可能是miR-101的靶基因。因此，我們檢測(cè)了結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中miR-101和KIF14蛋白的表達(dá)，同時(shí)觀察上調(diào)miR-101表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及KIF14 蛋白表達(dá)的影響，探討miR-101與結(jié)直腸癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料選取衡水市人民醫(yī)院2015年4月至2017年3月收治的50例結(jié)直腸癌患者，收集癌組織和距離癌組織5 cm的正常組織，標(biāo)本保存在液氮中；患者男33例，女17例，年齡41～73歲。正常結(jié)直腸細(xì)胞FHC和結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、HT29、LoVo、SW620、SW480購(gòu)自美國(guó)ATCC。miR-101 模擬物、模擬物陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；突變型和野生型KIF14熒光素酶報(bào)告載體(pMIR-LUC-3’-UTR-KIF14-MUT和pMIR-LUC-3’-UTR- KIF14-WT)由廣州輝駿生物科技有限公司構(gòu)建；RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；KIF14抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；PCR所用試劑均購(gòu)自美國(guó)ABI公司，引物由金唯智生物公司合成；Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2miR-101和KIF14靶向關(guān)系的鑒定用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pMIR-LUC-3’-UTR-KIF14-MUT、pMIR-LUC-3’-UTR-KIF14-WT分別與miR-101 模擬物、陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞中，48 h后，用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中miR-101和KIF14蛋白表達(dá)的檢測(cè)

1.3.1 miR-101的檢測(cè) 用Trizol試劑提取結(jié)直腸癌和癌旁正常組織的總RNA，提取FHC和HCT116、HT29、LoVo、SW620、SW480細(xì)胞(1×107個(gè))的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 。以cDNA為模板進(jìn)行PCR。miR-101 引物F： 5’-GCATG CTCGAGCGTTCTTGGTCCTGTCCCTT-3’，R：5’-TAAGCGGCCGCACCCGTGACACTTTCATTCC-3’。內(nèi)參U6引物F： 5’-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3’，R：5’-ATGGAACGCTTCACGAATTTG-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)水平。

1.3.2 KIF14蛋白的檢測(cè) 提取結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織總蛋白，提取FHC和HCT116、HT29、LoVo、SW620、SW480細(xì)胞的總蛋白。蛋白樣品在上樣前與Loading Buffer混合煮沸5 min，每孔上樣

30 μg。配制100 g/L的下層膠和50 g/L的上層膠。上層膠電壓80 V，下層膠電壓120 V，電泳時(shí)間2 h。在200 mA電流條件下將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用50 g/L牛血清白蛋白室溫環(huán)境中孵育1 h，依次加KIF14一抗、HRP二抗反應(yīng)，ECL發(fā)光，用Labwork對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參。以目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.4上調(diào)miR-101表達(dá)后結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞生長(zhǎng)情況及KIF14蛋白的表達(dá)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將miR-101 模擬物和陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞中(miR-101組和陰性對(duì)照組)，操作參照Lipofectamine2000說(shuō)明。以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為正常對(duì)照組。

1.4.2 細(xì)胞增殖測(cè)定 將3組細(xì)胞接種于96孔板，每孔3 000個(gè)細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔添加10 μL的MTT溶液孵育4 h，然后添加二甲基亞砜溶液孵育10 min。設(shè)置空白調(diào)零孔，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的光密度(OD)值。

1.4.3 細(xì)胞凋亡率測(cè)定 3組細(xì)胞培養(yǎng)48 h以后，用PBS洗滌，調(diào)細(xì)胞密度為106個(gè)/mL。取1 mL細(xì)胞懸液，1 000g離心10 min，取沉淀，添加300 μL的Binding Buffer混合，然后添加PI和Annexin V-FITC，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.4.4 KIF14蛋白的表達(dá) 檢測(cè)方法同1.3.2。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。結(jié)直腸癌及正常組織中miR-101 和KIF14蛋白表達(dá)水平的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，6種細(xì)胞中miR-101 和KIF14蛋白表達(dá)水平的比較、3組HT29細(xì)胞OD、凋亡率和KIF14蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1miR-101與KIF14靶向關(guān)系的鑒定miR-101與KIF14的3’UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。共轉(zhuǎn)染miR-101 模擬物和野生型KIF14熒光素酶報(bào)告載體后HT29細(xì)胞熒光素酶活性降低。

圖1 miR-101與KIF14的3’UTR結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

組別野生型突變型陰性對(duì)照1.00±0.111.03±0.18miR-1010.48±0.06*0.96±0.16t7.190 0.503P<0.001 0.641

*：與陰性對(duì)照組比較，P<0.05

2.2結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中miR-101和KIF14的表達(dá)見(jiàn)圖2和表2、3。結(jié)直腸癌組織中miR-101陽(yáng)性率達(dá)71.25%。結(jié)直腸癌組織和結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-101表達(dá)下調(diào)，KIF14蛋白表達(dá)上調(diào)。選用HT29細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 KIF14在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

組別miR-101KIF14蛋白正常組織0.73±0.090.32±0.11結(jié)直腸癌組織0.34±0.13*0.85±0.24*t17.4413.39P<0.001<0.001

表3 正常結(jié)直腸細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-101和KIF14蛋白的表達(dá)(n=3)

*：與FHC比較，P<0.05

2.3上調(diào)miR-101表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞增殖、凋亡和KIF14蛋白表達(dá)的影響各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。上調(diào)miR-101表達(dá)后HT29細(xì)胞增殖活性下降，細(xì)胞凋亡率升高,KIF14蛋白表達(dá)水平下降。

表4 轉(zhuǎn)染miR-101后HT29細(xì)胞增殖情況、凋亡率和KIF14蛋白的表達(dá)(n=3)

*：與兩個(gè)對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

miRNA通過(guò)與靶基因的3’UTR結(jié)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。一個(gè)miRNA可能靶向調(diào)控多個(gè)靶基因，發(fā)揮多種生物學(xué)作用[6-7]。目前發(fā)現(xiàn)miR-101可以調(diào)控的靶基因有EZH2、COX-2、FOS、Mcl-1等[2,8]。miR-101在不同組織器官中通過(guò)調(diào)控不同的靶基因發(fā)揮生物學(xué)功能[9]。研究[10-13]表明，miR-101水平越低，肺癌惡性程度越高；miR-101在肺癌、骨肉瘤等腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。miR-101對(duì)子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌等的抗腫瘤作用也已被證實(shí)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-101在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)水平均降低，上調(diào)miR-101表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明miR-101在結(jié)直腸癌中發(fā)揮類(lèi)似抑癌基因的作用。

KIF14基因定位于1q32.1，其編碼的蛋白質(zhì)含有1 648個(gè)氨基酸，屬于N型驅(qū)動(dòng)蛋白，含有一個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白、一個(gè)N末端延伸、一個(gè)驅(qū)動(dòng)蛋白馬達(dá)結(jié)構(gòu)域；其在正常人類(lèi)胸腺組織中低表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程[16]。研究[17-19]發(fā)現(xiàn)，KIF14可以作為一種癌基因，促進(jìn)諸如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、卵巢癌、肝癌等腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KIF14在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與上述研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，miR-101能夠與KIF14的3’UTR結(jié)合，靶向負(fù)調(diào)控KIF14的表達(dá)；miR-101可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)KIF14蛋白的表達(dá)，參與調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

總之，miR-101通過(guò)靶向調(diào)控KIF14，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡，這為研究結(jié)直腸癌分子發(fā)生機(jī)制提供了思路。