肝龍膠囊對豬血清誘導的肝纖維化大鼠的治療作用

李 燕，邵明園，國 超，楊強麗，曹昌娥，賴 泳，2*

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000）

肝纖維化是肝細胞持續性損傷導致機體炎癥、組織自我修復慢性激活的過程，若治療得當或及早、及時治療可使肝纖維化發生逆轉〔1-2〕；反之，則可發展為肝衰竭、肝硬化、肝癌〔3〕。隨著肝纖維化的發生、發展，胸腺、脾臟指數可有一定程度的降低；受損的肝臟充血、水腫、代償性增生、肥大等，肝臟指數隨之升高〔4-5〕。肝內巨噬細胞在肝纖維化時產生大量的轉化生長因子β1（TGF-β1），促使肝星狀細胞（HSC）產生過量細胞外基質（ECM），引起ECM的主要成分Ⅰ型膠原（COL-Ⅰ）、層粘連蛋白（LN）、透明質酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）水平的上調〔5〕。參與肝細胞損傷、凋亡的自由基（ROS）可使γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）含量增加〔6〕，亦可激活HSC或促進HSC分泌TGF-β1，而生物膜中的不飽和脂肪酸脂質過氧化的產物丙二醛（MDA）可間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度〔7-8〕。

中藥治療肝纖維化對于減緩病情進展具有積極的作用〔4〕，肝龍膠囊是由有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲美洲大蠊（俗稱“蟑螂”）研發而成的國家二類中藥新藥，具有抗病毒、抗氧化、防治慢性酒精性肝損傷、修復多種刺激所致的肝損傷及免疫調節的作用〔9-10〕。課題組前期研究結果表明肝龍膠囊能顯著降低豬血清誘導的肝纖維化大鼠肝臟中COL-ⅠmRNA、TIMP-ⅠmRNA的表達水平，且臨床上肝纖維化非創性早期診斷主要通過檢測與ECM生成相關的物質（HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ）的代謝水平、細胞因子TGF-β1、γ-GT指標來反映肝纖維化及其程度，所以本文通過豬血清大鼠模型觀察肝龍膠囊在抗肝纖維化治療中對臟器指數、LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1、γ-GT、MDA指標的影響，為其臨床應用提供實驗依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 水飛薊賓膠囊（天津天士力圣特制藥有限公司，批號：16041601）；肝龍膠囊（昆明賽諾制藥有限公司，批號：550706087）；豬血清（北京燕生政博生物科技有限責任公司，批號：20210922）；冰醋酸（天津市瑞金特化學品有限公司，批號：20130114）；異氟烷（力諾集團山東科源制藥股份有限公司，批號：131102）；COL-Ⅰ、PCⅢ、Ⅳ-C、LN、HA測試盒，TGF-β1試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20161220）；γ-GT、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20161223、201612237）。

1.2 材料 SD雄性健康成年大鼠，體質量160～200g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產許可證：SCXK（湘）2011-0003；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：ML204∕02）；酶標儀（奧地利安圖斯公司，型號：201）；臺式離心機（上海離心機械研究所，型號：TL-16R）。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 SD大鼠適應性飼養3 d后，隨機分為空白組、模型組、水飛薊賓膠囊組（7 mg∕kg）、肝龍膠囊高劑量組（120 mg∕kg）、肝龍膠囊中劑量組（60 mg∕kg）、肝龍膠囊低劑量組（30 mg∕kg），共6組，每組8只?？瞻捉M正常飼養，其余各組用未滅活豬血清腹腔注射，每次0.5 mL∕只，2次∕周，連續10周。為維持病因刺激和避免模型自然恢復，治療期間仍每天腹腔注射1次豬血清，每只注射0.6 mL。

1.3.2 給藥 10周造模結束后，空白對照組：給予蒸餾水灌胃，0.5 mL∕100 g；水飛薊賓膠囊組：7 mg∕kg，3次∕d；肝龍膠囊高劑量組：120 mg∕kg，2次∕d；肝龍膠囊中劑量組：60 mg∕kg，2次∕d；肝龍膠囊低劑量組：30 mg∕kg，2次∕d。給藥容量均為0.5 mL∕100 g。

1.3.3 樣本采集與處理 末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h。稱重、記錄，用異氟烷使大鼠吸入麻醉，立即剖開腹腔，腹主動脈取血。血液靜置4 h后，以3 000 r∕min的速度離心5 min后，取上層血清，根據各個待測指標所需的量分裝后，放于-80℃冰箱保存備用。暴露并取出肝臟、脾臟、胸腺于冰生理鹽水中洗滌，濾紙吸干水分，稱重、記錄并分裝于自封袋中，于-80℃冰箱保存備用。

1.3.4 生化指標的檢測 將血清、肝臟組織上清液從-80℃冰箱取出，-20℃冰箱過夜后，4℃冰箱解凍，檢測前常溫放置待用。所有檢測指標（LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1、γ-GT、MDA）按各自試劑盒說明書操作。

1.4 統計學處理 數據采用SPSS 17.0統計軟件處理，計數資料采用χ2檢驗，計量資料數據用（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析、LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況觀察 大鼠造模前：所有大鼠活潑好動，精神狀態良好，毛發光澤，飲食正常。造模期間：各組大鼠的平均體質量均呈逐漸上升趨勢，從第5周開始空白組較造模組大鼠體質量增長快，造模前后兩組大鼠體質量增加比較差異有統計學意義（P＜0.05）；從第6周開始，造模組大鼠精神萎靡、嗜睡、毛發不整且無光澤，小便顏色較空白組的黃，大便較空白組大鼠更軟；給藥后：大鼠精神狀態改善，脫毛現象減輕，大小便顏色逐漸恢復正常，體質量增長與空白組差異變小。

2.2 肝龍膠囊對豬血清誘導的肝纖維化大鼠體質量、臟器指數的影響 與空白組相比，模型組大鼠肝重指數、脾重指數均顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與空白組相比，模型組大鼠體質量、胸腺指數有所降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，肝龍膠囊給藥組脾重指數、胸腺指數升高，中、高劑量組升高明顯（P＜0.05）；肝龍膠囊給藥組體質量、肝重指數與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量增加、肝指數、脾指數、胸腺指數比較表（）

表1 各組大鼠體質量增加、肝指數、脾指數、胸腺指數比較表（）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05 ，▲▲P＜0.01 。

空白組模型組水飛薊賓膠囊組肝龍膠囊0.55±0.19 0.48±0.17 0.74±0.27 0.64±0.11**1.08±0.51**▲▲1.00±0.25▲▲■■■■■低劑量組中劑量組高劑量組225.43±19.01 193.44±21.58 174.36±27.23*219.36±42.37 159.57±6.36*175.58±58.84*2.46±0.14 3.05±0.25**2.96±0.12**2.97±0.28**3.31±0.23**3.04±0.24**1.60±0.16 3.28±0.23**3.33±0.53**3.56±0.26**7.63±1.58**▲▲4.80±2.20**▲

2.3 肝龍膠囊對豬血清誘導的肝纖維化大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量的影響與空白組相比，模型組大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量均升高（P＜0.05）；模型組大鼠血清COL-Ⅰ、TGF-β1含量與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，肝龍膠囊低劑量組使大鼠血清中LN、TGF-β1、PCⅢ、Ⅳ-C含量降低（P＜0.05）；肝龍膠囊中、高劑量組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C含量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；肝龍膠囊給藥組大鼠肝組織COL-Ⅰ含量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

表2 各組大鼠血清LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.4 肝龍膠囊對豬血清誘導的肝纖維化大鼠肝組織LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量的影響與空白組比較，模型組大鼠肝組織HA、Ⅳ-C含量升高（P＜0.05）；與空白組比較，模型組大鼠肝組織LN、PCⅢ、COL-Ⅰ、TGF-β1含量與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，肝龍膠囊給藥組使大鼠肝組織LN含量降低（P＜0.01）；與模型組比較，肝龍膠囊中劑量組使大鼠肝組織HA含量降低（P＜0.05）；肝龍膠囊低、高劑量組使大鼠肝組織HA含量升高，但與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，肝龍膠囊低、高劑量組使大鼠肝組織Ⅳ-C含量降低（P＜0.01）；肝龍膠囊中劑量組使大鼠肝組織Ⅳ-C含量升高，但與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，肝龍膠囊中、高劑量組使大鼠肝組織COL-Ⅰ含量升高（P＜0.05）；肝龍膠囊低劑量組使大鼠肝組織COL-Ⅰ含量降低，但與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，肝龍膠囊低劑量組使大鼠肝組織TGF-β1含量降低（P＜0.05）；肝龍膠囊中劑量組使大鼠肝組織TGF-β1含量升高，但與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；肝龍膠囊給藥組大鼠肝組織PCⅢ含量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.5 肝龍膠囊對豬血清誘導的肝纖維化大鼠肝組織γ-GT、MDA含量的影響 模型組大鼠肝組織γ-GT、MDA含量與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組相比，肝龍膠囊給藥組使大鼠肝組織γ-GT含量降低，其中低、高劑量組與模型組的差異有統計學意義（P＜0.05）；肝龍膠囊給藥組大鼠肝組織MDA含量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表3 各組肝臟組織LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

表3 各組肝臟組織LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ、TGF-β1含量（，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 。

空白組模型組水飛薊賓膠囊組肝龍膠囊646±136.57 800.33±193.85 631.25±62.38 467.85±213.81▲▲629.88±250.00 590.76±129.71■■■■■低劑量組中劑量組高劑量組16.19±1.19 30.97±8.70**20.74±2.41*▲▲31.15±2.52**24.84±1.07**▲33.91±4.52**540±38.38 597±52.08 528.63±80.38▲484.77±52.63▲▲312.57±55.63**▲▲305.75±47.79**▲▲73.54±4.97 63.15±11.15 49.32±13.07*▲65.91.±8.79 71.19±13.27 64.62±12.45 110.83±6.50 209.01±138.35*65.34±2.45▲▲106.69±1.72▲▲243.72±56.07*82.75±5.41▲▲11.99±8.69 23.10±2.28 17.51±10.37 20.00±3.76 42.79±15.52**▲41.77±4.31**▲

表4 各組肝臟組織γ-GT、MDA含量（，n=8）

表4 各組肝臟組織γ-GT、MDA含量（，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

3 討論

有文獻報道，豬血清以異種抗原的身份侵入，刺激機體產生免疫反應，使機體呈現主動的肝纖維化，或作為炎癥因子，刺激機體釋放細胞因子，激活HSC，使ECM過度沉積引起肝纖維化〔8〕。其誘導的肝纖維化模型在存在較小的肝細胞損傷、模型持續時間長、自愈率低、對實驗結果影響小、對動物整體損傷輕微等特點的同時，具有強烈的免疫應答能力，其纖維化發生機制與臨床上慢性肝炎所致肝纖維化接近〔11-12〕。因此，采用豬血清誘導大鼠肝纖維化模型。肝纖維化時，ECM增生、沉積的主要成分是COL-Ⅰ、PCⅢ；由間充質細胞產生的糖胺聚糖HA反映肝纖維化和肝損傷；基底膜的主要成分LN、Ⅳ-C在基底膜增生、肝竇毛細血管化過程中含量增加〔13〕。5種標記物是不同類型的蛋白質，其增加的機制也不同，因此，幾個標記物的聯合測試具有扎實的理論基礎。與空白組比較，模型組大鼠血清及肝臟組織各指標除MDA外，其余指標的含量均高于空白組，是因為豬血清通過MHCⅡ類分子和炎癥分子激活HSC轉變為肌成纖維細胞（MFB），表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），使肝臟內免疫細胞釋放免疫調節因子、細胞因子，導致ECM過度沉積，LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、COL-Ⅰ水平上調，導致肝功能降低，肝功能指標∕肝纖維化間接標志物γ-GT含量增加、肝臟生理結構被破壞，從而形成肝纖維化〔14-15〕；MDA含量未發生變化與豬血清對肝細胞的損傷小，使自由基不能作用于脂質誘導機體發生氧化應激過量產生ROS（活性氧類）有關。

脾臟、胸腺是機體的免疫器官，其臟器指數的高低與免疫功能的強弱、免疫活性細胞的數量有關。肝龍膠囊給藥組脾重指數、胸腺指數高于模型組，且胸腺增重一般被認為可能有增強機體免疫力的作用，故提示肝龍膠囊可提高機體的免疫力。肝重指數與模型組比較有輕微的增高或降低，但差異無統計學意義，且給藥組大鼠體質量均低于模型組的同時并未做病理檢測，可能是體質量的降低造成臟器指數的假陽性增高或降低，所以并不能說明肝臟是否有增生、充血、肥大等現象。

TGF-β1促進肝纖維化有3種途徑：首先，TGF-β1抑制基質金屬蛋白酶（MMP）或促進基質金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）表達，抑制ECM降解；其次，TGF-β1通過管狀細胞誘導MFB形成上皮間質轉化（EMT）；最后，TGF-β1通過Smad3依賴或Smad非依賴途徑誘導機制產生〔16〕。受損肝細胞刺激引起巨噬細胞所分泌的TGF-β1與胞膜上的TGF-β1Ⅱ（TβRⅡ）結合，磷酸化的TβRⅡ激活TβRⅠ，活化的TβRⅠ與Smad2∕3結合，使COL-Ⅰ產生，從而形成肝纖維化〔11，17〕。而Smad蛋白是TGF-β1的關鍵細胞內效應物，在抗肝纖維化方面，Smad2直接下調COL-Ⅰ表達，或由TGF-β1誘導產生的保護型Smad7通過抑制TβRⅠ與Smad2∕3的結合阻斷TGF-β1的過度激活，從而下調COL-Ⅰ表達；在促肝纖維化方面，Smad3直接上調COL-Ⅰ的表達，或Smad4通過調節Smad3上調COL-Ⅰ的表達，亦使ECM過度沉積。藥物治療組大鼠血清和肝臟組織中TGF-β1的含量及大鼠肝臟組織LN含量在一定程度上均低于模型組，提示各藥物治療都起到一定的作用。曾有文獻報道〔18〕，肝龍膠囊抗肝纖維化可能與降低肝纖維化細胞因子的表達有關，所以可以解釋大鼠肝臟組織LN含量的降低。肝龍膠囊給藥組對大鼠肝組織PCⅢ無影響的同時會使COL-Ⅰ的含量增加，表明肝龍膠囊抗肝纖維化的作用機制與PCⅢ、COL-Ⅰ無關。

治療組中其余各指標對模型組升高的指標不呈線性關系，有的還顯示某一濃度降低而其余濃度對其無影響的結果，推測可能的原因是肝龍膠囊對肝纖維化大鼠中升高的各個指標都有不同的適宜的治療濃度范圍，當濃度超過或低于一定范圍時，肝龍膠囊對其就沒有作用或起相反的作用。對于以上結果，可以考慮與其他藥物聯合使用，以此為臨床治療提供更好的治療方案。