28種AM真菌對滇重樓中薯蕷皂苷元含量的影響

王 騫，張輝菊，楊 敏，張 華 ，周 濃，李 楊

（1.大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000；2.重慶三峽學院生物與食品工程學院，重慶 404120；3.三峽庫區道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120；4.大理大學學報編輯部，云南大理 671003）

滇重樓（Parispolyphyllavar.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.）為百合科重樓屬植物云南重樓的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛等功效，在西南地區是著名的具有產業化利用主導地位的中藥材，已被列為國家重點保護二級瀕危藥用植物〔1-3〕。隨著市場需求量不斷增加，供需矛盾日益突出，人工栽培技術雖不斷提高，可在一定程度上緩解該矛盾，但仍存在入藥質量不穩定等問題〔4-8〕。現有研究表明叢枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM）真菌可以提高多數藥用植物的產量和品質〔9-10〕，為解決入藥質量不穩定這一問題，本研究通過對滇重樓根莖部位接種28種不同的AM真菌，探討AM真菌對其侵染率和品質的影響，并篩選出可以提高其主要藥用品質指標成分含量的AM真菌菌種，從而為人工栽培滇重樓施用生物肥料，提高入藥品質提供科學理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100 LC高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RV 10 basic V型旋轉蒸發儀（德國IKA集團）；SHZ-Ⅲ循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；CP225D型分析天平（德國Sartorius公司）；FZ102型微型植物試樣粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司）。

1.2 試藥 薯蕷皂苷元對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0124，含量≥98%）；乙腈（色譜純，美國Tedia試劑公司）；水為娃哈哈純凈水；其他所用試劑均為國產分析純。

1.3 供試材料與培養 AM真菌均為AM真菌純凈菌劑（購于美國國際叢枝菌根真菌種質資源保藏中心），接種菌劑為帶有菌絲、孢子及侵染后根段的栽培基質的混合物〔11-12〕。不同處理組接種AM 真菌種類為：Ga處理組（Gigaspora albida）、Gd處理組（G.decipiens）、Gg處理組（G.gigantea）、Gm處理組（G.margarita）、Gr處理組（G.rosea）、Sca處理組（Scutellospora calospora）、Sdi處理組（S.dipurpura-scens）、Spe處理組（S.pellucida）、Dh處理組（Dentiscutata heterogama）、Rco處理組（Racocetra coralloidea）、Rfu處理組（R.fulgida）、Sde處理組（Septoglomus deserticola）、Svi處理組（S.viscosum）、Cc處理組（Claroideoglomus claroideum）、Fm處理組（Funneliformis mosseae）、Rcl處理組（Rhizophagus clarus）、Rin處理組（R.intraradices）、Afo處理組（Acaulospora foreata）、Ako處理組（A.koskei）、Asc處理組（A.scrobiculata）、Asp處理組（A.spinosa）、De處理組（Diversispora eburnea）、Ds處理組（D.spurca）、Ec處理組（Entrophospora colombiana）、Pb處理組（Paraglomus brasilianum）、Po處理組（P.occultum）、Ale處理組（Ambispora leptoticha）、Atr處理組（Archaeospora trappei）〔13-14〕。

實驗樣品選自大理州農科院種植基地大小基本一致的滇重樓新鮮根莖，經重慶三峽學院周濃教授鑒定為百合科重樓屬植物滇重樓P.polyphyllavar.yunnanensis。栽培袋用10%次氯酸鈉溶液浸泡15 min后，用自來水沖洗干凈。栽培基質為重慶三峽學院百安校區的菜園土與河沙的混合物（體積比為3：1，過2 mm篩后，在121℃的高壓滅菌鍋內滅菌2 h）。采用室溫盆栽栽培的方法，設為AM組（接種28種AM真菌）和CK組（對照組），共29個處理組。每個處理組分別有6個平行，每盆栽種15株滇重樓。選擇大小一致的滇重樓根莖，將菌土均勻施于滇重樓根莖部，接種劑量為每盆15 mL（每1 mL大約含有60個孢子）。接種后在室溫（自然光照）條件下培養。生長期間，定期澆灌Hoagland營養液。

2 方法與結果

2.1 叢枝菌根對滇重樓根系菌根侵染率的影響隨機選取滇重樓根系30條，剪成長約1.0 cm的根段，采用曲利本藍染色法進行AM真菌的侵染率測定〔15〕。由圖1可以看出，各處理組的滇重樓根系均被AM真菌侵染，并形成了叢枝菌根結構，但侵染強度卻有所不同。同時，CK組滇重樓根系侵染率不為0.00%，可能是前期栽培土壤中含有一定量的真菌類群，致使滇重樓成年植株根系具有一定的菌根侵染，與周濃等〔8〕的研究結果一致。見圖1。與CK 組相比，Gg、Gm、Sca、Spe、Dh、Rco、Rfu、Sde、Cc、Rin和Ds共11種AM真菌對滇重樓根系侵染率最高，在59.00%～75.40%，且這11種AM真菌侵染率差異無統計學意義（P＞0.05）；與CK 組相比，Ga、Gd、Svi、Afo、Ako、Asc、Asp、De、Ec、Pb、Po、Ale和Atr共13種AM真菌對滇重樓根系侵染率居中，在40.00%～50.00%，且這13種AM真菌侵染率差異無統計學意義（P＞0.05）；Gr、Sdi、Fm和Rcl共4種AM真菌對滇重樓根系侵染率最低，在25.40%～32.60%，且這4種AM真菌侵染率與CK組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，28組AM真菌都對滇重樓有一定的侵染。由此可見，接種外源AM真菌對滇重樓根內AM真菌的侵染率、侵染強度具有調控作用。

圖1 接種不同AM真菌對滇重樓根系菌根侵染率的影響

2.2 叢枝菌根對滇重樓薯蕷皂苷元的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷元適量用甲醇溶解，配成0.539 mg∕mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約0.250 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取40 min，靜置放冷，過濾，再加入20 mL甲醇，超聲提取40 min，放冷，過濾，合并2次提取液，回收甲醇，殘渣加入2 mol∕L鹽酸7.5 mL，置于100℃水浴鍋中水解2 h，冷卻后萃取3次，每次用30 mL石油醚（60～90℃），萃取時間分別為45、40、30 min。合并3次萃取液，并回收石油醚至干，殘渣用甲醇溶解至10 mL量瓶中，定容，搖勻，即得〔16〕。

2.2.3 色譜條件 采用高效液相色譜法〔16〕測定不同處理組滇重樓薯蕷皂苷元的含量，色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（90：10），流速為 1.0 mL∕min，檢測波長203 nm，柱溫35℃。

2.2.4 線性關系考察 分別精密吸取1、2、5、10、15、20、25 μL對照品溶液，按照“2.2.3”項下色譜條件測定，得出以峰面積A為縱坐標，進樣量濃度C為橫坐標的線性回歸方程，A=649 532C+160 81（r=0.999 1）。線性范圍為0.539～13.475 μg∕mL。

2.2.5 精密度、重復性、穩定性和加樣回收率試驗通過對薯蕷皂苷元含量測定進行方法學考察，結果精密度試驗RSD為0.21%（n=6）；重復性試驗RSD為2.13%（n=6）；穩定性試驗RSD為1.29%（n=6）；平均加樣回收率為96.52%（n=6），RSD為2.16%（n=6）。結果均符合含量測定的要求。

2.2.6 測定結果 大部分AM真菌處理組中薯蕷皂苷元含量與CK組比較差異無統計學意義（P＞0.05），其含量波動范圍在（0.978 2 ±0.095 1）mg∕g（Sdi）到（8.153 0±0.774 8）mg∕g（Pb）之間。但經過Dh和Svi真菌處理后的滇重樓根莖中，薯蕷皂苷元含量均有提高。其中用Dh真菌處理過的根莖的薯蕷皂苷元含量為10.745 3 mg∕g，Svi處理組的薯蕷皂苷元含量為41.404 5 mg∕g，提高得最為明顯。這兩組與CK組的含量比較差異有統計學意義（P＜0.05）?？梢夾M真菌處理對滇重樓根莖中薯蕷皂苷元含量有影響，尤其是Svi真菌。見表1。

表1 不同AM真菌處理組的薯蕷皂苷元含量

3 討論

本實驗結果表明，不同處理組的滇重樓根莖均能與28種AM真菌形成共生關系，但不同AM真菌對滇重樓中薯蕷皂苷元含量的影響不同。接種AM真菌處理組的滇重樓菌根侵染率普遍高于CK組，部分差異有統計學意義，部分差異無統計學意義，這與周濃等〔16〕、楊光等〔17〕研究結果相一致。滇重樓的主要活性成分是甾體皂苷類化合物，包括薯蕷皂苷和偏諾皂苷等。薯蕷皂苷元是薯蕷皂苷水解得到的產物〔18-19〕，薯蕷皂苷元在制藥行業應用十分廣泛，是合成甾體激素類藥物的重要成分，具有解毒、抗腫瘤、抗炎、降血脂、免疫調節、保護胃黏膜等作用，為滇重樓的有效成分和質量控制指標之一。本實驗結果顯示AM真菌的接種有助于提高滇重樓中薯蕷皂苷元的含量，效果最佳者為Svi真菌。在周濃等〔11〕的研究中顯示接種Svi真菌，有助于提高侵染率，同時可提高重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的含量，也間接反映了Svi真菌是有助于提升滇重樓入藥品質的AM真菌。本研究僅針對滇重樓中一種入藥品質指標進行檢測，在今后的研究中還應進一步加強其他入藥品質指標的研究，為合理施用生物肥料，提高入藥品質奠定理論基礎。