茶多酚對重鉻酸鉀染毒小鼠肝臟損傷的影響*

彭敏，劉燕群，2，3△，唐元娟，程露，楊曄，甘維康，李杜（.江漢大學醫學院，湖北武漢430056；2.江漢大學光電化學材料與器件省部共建教育部重點實驗室，湖北武漢430056；3.江漢大學化環學院，湖北武漢430056）

工業上鉻的用途比較廣泛[1]，在某些職業環境中，鉻主要是以六價的形式存在于冶金等生產工業中。有相關實驗表明，在生產過程中接觸過多的六價鉻（Cr6+）會使人急性中毒而引起肝臟組織的損傷，嚴重時可誘發肺癌甚至是死亡[2]。日常生活中人們多有喝茶的習慣，茶多酚（TP）一般安全、無污染，且有強抗氧化作用，正逐漸受到人們的認可。TP的芳香環可通過結合氧自由基中的羥基來清除機體內的自由基，表現出強抗氧化能力[3]。肝臟是人體內新陳代謝的樞紐和重要的解毒器官。肝臟如果受到影響，將會影響到人體健康。有關重鉻酸鉀鉻損害的機制研究很多，但對其損害的修復研究報道較少[4-5]，沈海濤等[6]進行了TP干預毒物研究，而利用生活中常見的茶葉提取含有多酚類化合物TP干預重鉻酸鉀（PD）致小鼠肝臟損傷的相關研究鮮見報道。鑒于此，本實驗擬采用PD使致小鼠中毒后用TP進行干預，觀察分析小鼠肝活性氧化酶指標的變化和蘇木精-伊紅（HE）切片情況，探討TP對PD染毒小鼠肝臟損傷的影響，為相關研究提供實驗數據和分析依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 采用無特定病原體（SPF）昆明小鼠60 只，雌雄各半，體重（23±2）g，批號：42000600023316，購于湖北省實驗動物研究中心。小鼠身體狀態良好，安置于室溫（24±1）℃下，小鼠自由取水，每只小鼠喂食5 g飼料，適應性喂養3 d。之后稱取每只小鼠的體重，根據體重差異隨機分為5組，每組12只，雌雄各半，使每組小鼠的平均質量為30 g左右。

1.1.2 主要實驗儀器與試劑 TP（福州日冕科技開發有限公司），純度大于 98.0%；PD（K2Cr2O7，山東西亞化學股份有限公司），純度99.8%。JA2003B電子天平（上海越平科學儀器有限公司），PH100-3A41L-EP生物顯微鏡（江西鳳凰光學集團有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性實驗 （1）預實驗：隨機挑選A、B 2組小鼠進行預實驗。①A組：根據相關研究，PD染毒昆明小鼠后，腎臟重量和腎臟系數均有顯著升高，且濃度為21.375 mg/kg的組別升高最為明顯[7]。本研究采用1/8的PD半數致死量（LD50）為標準設置濃度梯度，1/4 LD50為上限，0為下限，設置8個濃度梯度，分別為1/4 LD50、1/8 LD50、1/12 LD50、1/16 LD50、1/20 LD50、1/24 LD50、1/32 LD50、0（生理鹽水）的PD溶液，分別給8只昆明小鼠灌胃。每6小時1次，每只每次灌胃0.3 mL，每天連續灌胃3次，連續灌胃3 d。不斷持續觀察小鼠的生活狀態和活動能力，3 d后解剖觀察小鼠肝臟變化情況，選出1個能使小鼠恰好表現中毒情況又不致死的適宜濃度作為正式實驗PD的灌胃濃度。解剖前，小鼠生活狀態不佳，精神萎靡，較安靜。解剖后，因為1/4 LD50組小鼠肝臟對比0（生理鹽水）組及其他組小鼠，肝臟腫大最明顯，顏色暗沉且色澤不均，仔細用肉眼可觀察到各葉肝臟邊緣及中部均有彌漫的小結節，表現出明顯病理特征。故以1/4 LD50為最適PD灌胃濃度進行正式實驗。②B組：經查閱相關文獻[6]，設置5個濃度梯度，分別以濃度為 200、300、400、500、600 mg/kg的 TP 溶液給 10只昆明小鼠灌胃，每個濃度組2只，灌完1/4 LD50PD溶液后隔4 h灌胃TP溶液即為一輪灌胃，每次灌胃量為0.3 mL，每天連續灌胃2輪，每天給另2只小鼠灌胃2次1/4 LD50PD溶液，作為對照組，連續灌胃3 d。解剖前，各組小鼠的活動能力和生活狀態沒有明顯區別。解剖后，對比各組小鼠肝臟病理特征，200、400、600 mg/kg組小鼠的肝臟色澤相對鮮紅，小結節較少，病理變化少。故選取200、400、600 mg/kg作為正式實驗TP灌胃濃度。（2）正式實驗：將60只昆明小鼠分為5組，每組12只，雌雄各半，在24℃室溫下分籠，早上08：00至晚上18：00燈光照明飼養。假設每只小鼠重量為30 g，每天灌胃量為0.3 mL。根據計算結果，配制濃度為4.275 mg/mL的1瓶PD溶液和濃度為200、400、600 mg/kg的3瓶TP溶液于4℃冰箱內避光儲存備用。對照組灌胃生理鹽水，PD染毒組灌胃42.75 mg/kg PD溶液；在灌胃PD 6 h后，TP 組分別按 200、400、600 mg/kg濃度灌胃TP溶液（即PD+L-TP組、PD+M-TP組、PD+H-TP組）。各組灌胃時間均為2周，每天1次；每只小鼠每次灌胃體積均為0.3 mL。觀察每天小鼠的生活狀態，記錄小鼠的體重。準備解剖之前，各組小鼠自由取水，最后1次灌胃后禁食24 h。解剖小鼠時，頸椎脫位法處死小鼠，采血、取肝臟稱重并制作肝臟的HE染色切片并計算其臟器系數；離心后的血清用全自動生化分析儀檢測肝組織谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、谷氨酰轉肽酶（GGT）水平。

1.2.2 肝組織HE染色切片的制作 處死并解剖全部小鼠并取其肝臟，稱量后，投入4%甲醛溶液中固定，保持細胞形態。乙醇脫水后，再將組織塊置于二甲苯中。石蠟包埋后切片，切成的薄片固定于載玻片上，放入45℃恒溫箱內烘干。二甲苯可脫去切片中的石蠟，再經過高濃度到低濃度乙醇洗脫后，用蒸餾水洗。HE染色后，制成肝的HE染色切片[8-10］。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件處理實驗各組相關數據，計量資料采用表示，并用單因素方差分析法進行組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠體重及肝臟臟器系數比較 PD染毒組體重和臟器系數均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；PD+L-TP、PD+H-TP組與PD染毒組比較，小鼠體重有一定程度的增加，PD+L-TP、PD+m-TP組小鼠肝臟臟器系數均低于PD染毒組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體重及肝臟臟器系數比較（±s）

表1 各組小鼠體重及肝臟臟器系數比較（±s）

注：與對照組同指標比較，aP＜0.05；與PD染毒組同指標比較，bP＜0.05

組別對照組PD染毒組PD+L-TP組PD+M-TP組PD+H-TP組n 12 12 12 12 12體重（g）30.78±1.18 26.87±2.61a 30.02±1.22b 28.75±1.46 30.07±3.26b肝臟臟器系數（%）4.69±0.61 5.25±0.33a 4.39±0.45b 4.34±0.25b 4.75±0.37

2.2 各組小鼠肝功能指標比較 PD染毒組小鼠血清ALT、AST、GGT水平均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；經不同劑量 TP 干預后，PD+L-TP、PD+m-TP、PD+H-TP組的血清 ALT、AST、GGT 水平均分別低于PD染毒組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠肝功能指標比較（±s）

表2 各組小鼠肝功能指標比較（±s）

注：與對照組同指標比較，aP＜0.05；與PD染毒組同指標比較，bP＜0.05

GGT（U/L）2.34±0.37 3.91±0.09a 2.90±0.68b 2.21±0.38b 2.85±0.78b組別對照組PD染毒組PD+L-TP組PD+M-TP組PD+H-TP組n 12 12 12 12 12 ALT（U/L）49.48±1.46 57.96±9.33a 42.60±3.68b 44.0±1.71b 41.43±0.63b AST（U/L）131.73±22.57 159.85±4.12a 134.15±8.21b 133.66±5.57b 134.58±13.51b

2.3 顯微鏡觀察 將各組小鼠肝臟HE染色切片分別置于低倍鏡和40倍光學顯微鏡下觀察，結果顯示，對照組（生理鹽水）肝小葉之間界限較清楚，細胞在肝小葉中部的中央靜脈周圍呈放射狀排列，肝細胞間連接緊密，可見肝血竇和門管區；小鼠肝細胞呈多邊形，細胞體積較大，細胞核大而圓，核仁明顯，染色質豐富（圖1）。PD染毒組肝小葉界限不清楚，肝細胞水腫，有部分細胞壞死，肝細胞界限不清，有雙核，核深染，有些中央靜脈輪廓不清楚，大多數充血（圖 2）。PD+L-TP、PD+m-TP、PD+H-TP組肝小葉界限較清楚，細胞輕度水腫，較少壞死，大多細胞界限清楚，中央靜脈大多輪廓清楚，充血少（圖3～5）。

圖1 對照組（HE染色，40×）

圖2 PD染毒組（HE染色，40×）

圖4 PD+M-TP組（HE染色，40×）

圖5 PD+H-TP組（HE染色，40×）

3 討 論

本實驗采用TP作用PD染毒小鼠肝臟，結果證實，在TP的干預下，TP對PD染毒肝臟所致的損傷有一定程度的保護作用。

實驗動物的臟器系數可反映毒物對臟器的綜合毒性損傷程度，其增大表明臟器出現了水腫、增生和充血等病理變化，若下降則說明器官表現出萎縮和退行性病變等變化[11]。動物的體重也是研究毒理學中非特異性觀察指標之一。體重和臟器系數可以綜合反映機體的中毒效應。本實驗圖2結果顯示，與對照組比較，PD染毒小鼠肝臟的臟器系數增高，說明PD溶液可引起肝臟水腫、壞死等病理變化，HE染色切片也顯示肝細胞水腫、出血，部分細胞壞死；PD染毒組小鼠體重下降，與李銀等[12]的實驗結果一致。主要是由于PD在體內蓄積引起的毒性反應，致小鼠消化不良，食欲不振，從而進食量減少，這也是小鼠體重下降的直接原因。本研究圖3～5表明，經不同劑量TP干預后，小鼠肝臟臟器系數均呈不同程度降低，體重增加，表明TP干預后可減輕PD蓄積毒性對機體的影響，不斷改善和修復PD對肝臟的損傷作用，并使其生理功能逐漸恢復而增加體重，HE染色切片顯示肝細胞界限較為明顯，出血和壞死情況較少。

分析肝臟功能最常用的方法是肝酶活性的檢測，這通常也是研究肝臟損害較常規和便捷的方法之一。相關研究表明，嚴重損傷的肝細胞一般會出現ALT、AST和GGT水平升高，三者的變化能夠幫助判斷肝臟是否損傷及其損傷程度和性質[13]。本實驗結果顯示，PD染毒組ALT、AST、GGT 3項指標水平均升高，表明PD可增強脂質過氧化而損傷肝臟；TP干預后，ALT、AST、GGT水平均低于PD染毒組，說明TP對PD引起的肝酶升高和肝臟組織形態破壞均有不同程度的保護作用，可能與其表現出的強大抗氧化能力有關。但其具體保護機制及其所需的最佳濃度尚需要進一步深入研究探討。