GC7通過抑制eIF5A2活性增強槐耳醇提取物對胃癌細胞的增殖抑制作用

孫建城 王曉峰 倪益秀 朱浩特 徐志遠 程向東?

胃癌在全球病死率高居第二位，目前常用手術聯合化療，然而術后易復發，化療緩解率低而毒性高。研究發現，eFI5A2是重要的腫瘤促進分子，其含有hypusine殘基，hypusine形成在蛋白調控細胞增殖和凋亡中發揮重要作用，其經hypusination活化后不僅可維持細胞的增殖，還能延緩腫瘤細胞的細胞周期［1］。GC7作為一種新型的高度親和性和選擇性的DHPS抑制劑［2］，通過抑制eIF5A2的hypusination抑制腫瘤細胞增殖［3］。在多種腫瘤細胞系（如膠質母細胞瘤［4］）中均已經觀察到該化合物通過抑制eIF5A2的起抑制增殖作用，被認為是抑制腫瘤生長的有效途徑。本中心采用多種提取方法提取槐耳正丁醇［5］，旨在探討eIF5A2與胃癌細胞的增殖之間的關系，研究GC7與槐耳醇提取物聯合對各種胃癌細胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株及其培養 人胃癌細胞株MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27購自中國科學院細胞庫，在37℃、5% CO2的二氧化碳培養箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養細胞，用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。

1.2 主要藥物與試劑 槐耳醇提取物由浙江省中醫院中心實驗室提供，Deoxyhypusine Synthase Inhibitor（GC 7）購自Millipore公司。RPMI-1640細胞培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自Cellmo公司，0.25%胰蛋白酶消化液購自索萊寶科技有限公司，二甲基亞砜（DMSO） 購自Sigma 公司，PBS購自HyClone公司，CCK-8試劑盒購自東仁化學科技有限公司，anti-eIF5A2 antibody購 自abcam公 司，anti-GAPDH antibody，鼠二抗，兔二抗均購自Cell Signaling Technology公司，BCA 試劑盒，RIPA裂解液（Strong），TBS（PH8.0），10%SDS均購自康為世紀生物科技有限公司，30%丙烯酰胺溶液購自麥克林生化科技有限公司。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自Invitrogen公司。Western blot細胞裂解液、電化學發光液（ECL）試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 細胞增殖實驗（CCK-8法） 收集對數期腫瘤細胞，按3×103個/孔接種于96孔板（100μl每孔），另設置一行空白組，不接種細胞。放回37℃培養箱繼續培養24h后，吸棄原培養液，再分別加入100μl槐耳醇提取物溶液，藥物濃度梯度為：31.25μg/ml，62.5μg/ml，100μg/ml，125μg/ml，250μg/ml共計五組，每個濃度梯度設置6個復孔，同時在空白組加入不同濃度梯度的槐耳醇提取物溶液；在對照組中加入不含藥物的RPMI-1640培養液。培養24h后，按照說明書，向實驗組、空白組和對照組各孔中加入10μlCCK-8溶液，放回培養箱繼續培養30～90min后，放入全自動酶標儀中，設定測定波長為450nm，測定其吸光度（OD）值計算其均值。用公式計算細胞生長抑制率。實驗重復三次。抑制率（%）=［1-（各實驗組OD值-各空白組OD值）/（對照組OD均值-對應空白組OD均值）］×100%，應用SPSS 23.0計算其半數最大抑制濃度（IC50）。

1.4 Western blot 檢測 提取各分組細胞蛋白，Bradford法蛋白定量后SDS-PAGE電泳及轉膜，封閉液常溫封閉1h。TBST漂洗3次，每次10min后，將一抗eIF5A2和GAPDH與一抗稀釋液按照1：1000比例稀釋，4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10min，將二抗與5%牛奶按照1：3000比例稀釋，4℃孵育2h。用TBST漂洗3次，每次10min后用ECL顯色液顯色。利用Alpha 凝膠成像系統及Photoshop CC 2017軟件，對蛋白條帶進行灰度掃描和分析。實驗重復三次。1.5 統計學方法 采用SPSS23.0統計軟件。計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槐耳提取物對不同胃癌細胞的增殖抑制作用存在差異 通過CCK-8測定各種濃度梯度的槐耳醇提取物處理后的細胞存活率。細胞存活率隨著槐耳醇提取物濃度的增加而下降，MGC-803細胞 的 IC50為（112.0±5.7）μg/ml，BGC-823細 胞的 IC50為（148.1±12.81）μg/ml，AGS細 胞 的 IC50為（192.7±10.65）μg/ml，HGC-27細 胞 的 IC50為（133.7±6.71）μg/ml。結果表明，槐耳醇提取物具有抑制胃癌細胞增殖的作用且MGC-803細胞對槐耳醇提取物最為敏感性，AGS細胞對槐耳醇提取物的敏感性最弱（見圖1）。

圖1 槐耳醇提取物對不同胃癌細胞系的增殖抑制作用

2.2 不同胃癌細胞表達的eIF5A2量存在差異 通過Western blot實驗檢測 MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27細胞中eIF5A2的表達量。結果表明，eIF5A2蛋白在不同胃癌細胞中的表達量存在差異，其中MGC-803細胞表達的eIF5A2蛋白量最少，AGS細胞表達的蛋白量最多（圖2A）。通過Western blot實驗檢測槐耳醇提取物處理四種胃癌細胞24h后細胞中eIF5A2蛋白的表達量，槐耳醇提取物的濃度設為四種胃癌細胞相對應的IC50和1/2 IC50值。結果表明，槐耳醇提取物作用胃癌細胞后，不同胃癌細胞中eIF5A2的表達量不同程度的上調，隨著槐耳醇提取物用藥濃度的升高，eIF5A2表達量上調，與對照組相比具有統計學差異（P＜0.05）（圖 2B-E）。

2.3 低濃度的GC7對胃癌細胞的增殖無抑制作用 據報道，低濃度的GC7對肺癌、乳腺癌細胞無影響，GC7對胃癌細胞的毒性尚未報道，為了確定GC7與槐耳醇提取物共同給藥的適當濃度，進行了CCK-8實驗以測試GC7在胃癌細胞MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27中的細胞毒性。結果顯示：濃度在0～6.25μmol/L之間，低濃度的GC7對胃癌細胞幾乎無細胞毒性，細胞存活率未受到明顯影響（P＞0.05）。且已有研究證實，5μmol/L的GC7對其他癌癥細胞（如肺癌、乳腺癌、膀胱癌）產生較小的細胞毒性，但是能特異性的抑制eIF5A2的hypusination，從而特異性抑制腫瘤細胞表達的eIF5A2蛋白活性。因此，作者使用5μmol/L的GC7，在不影響胃癌細胞活力又可以抑制eIF5A2激活的情況下與槐耳醇提取物共同給藥。

2.4 GC7作用于不同胃癌細胞12h后，不同程度增強了槐耳醇提取物對胃癌細胞的抑制作用 通過CCK-8實驗測試了5μmol/L的GC7作用胃癌細胞12h后，再用上述提到的各種槐耳醇提取物濃度作用胃癌細胞后觀察細胞存活率。結果發現四種胃癌細胞的IC50均發生了改變，其中MGC-803細胞的IC50降低至（103.6±5.44）μg/ml，BGC-823細胞的IC50從原來的（148.1±12.81）μg/ml降低為（126.3±7.89）μg/ml，AGS細胞的IC50降低至（158.2±7.39）μg/ml，HGC-27細胞的IC50降低為（101.1±7.87）μg/ml。結果表明，在GC7作用四種細胞株12h后，槐耳醇提取物對胃癌細胞增殖抑制作用有不同程度提高，細胞存活率隨著槐耳醇提取物用藥濃度的升高而下降，其中MGC-803細胞的IC50變化差異無統計學意義（P＞0.05），AGS、BGC-823和HGC-27細胞的IC50變化差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖2 A：通過Western blot檢測四種胃癌細胞MGC-803、BGC-823、AGS、HGC-27的eIF5A2表達量。B-E：用濃度梯度為不同細胞各自的IC50和1/2 IC50的槐耳醇提取物濃度處理（B） MGC-803 、（C） BGC-823、（D）AGS、（E） HGC-27細胞24h并與空白對照組細胞相比。通過Western blot實驗測定eIF5A2的表達量（?P ＜0.05）。 ++：用不同細胞各自的IC50濃度的槐耳醇提取物處理胃癌細胞24h。+：用不同細胞各自的1/2 IC50濃度的槐耳醇提取物處理胃癌細胞24h。-：空白對照組。

3 討論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在我國是癌癥防治的重點。細胞遺傳學研究發現，人類數種惡性上皮性腫瘤細胞中染色體區存在高頻擴增，提示這些區域可能存在某些癌基因，其擴增和高表達可能在惡性腫瘤發生、發展中發揮重要作用。在多種腫瘤中3q26染色體常表現擴增異常或不穩定，2001年，Guan等［6］從人卵巢癌細胞UACC-1598染色體3q26高擴增區內克隆出新的基因eIF5A2，該現象提示eIF5A2可能是腫瘤形成與轉移基因。eIF5A2在人體大部分正常組織不表達，卻在一些腫瘤細胞內（如卵巢癌和結腸癌內等）明顯的特異性表達，即eIF5A2具有腫瘤特異性表達的特點。在動物實驗中發現，eIF5A2的過度表達引起細胞的轉化/錨地獨立的增長，并使裸鼠致瘤［7］。本研究發現，四種胃癌細胞株中均發現了eIF5A2表達，其中表達eIF5A2蛋白高的胃癌細胞AGS、BGC-823、HGC27比表達低的MGC-803細胞對槐耳醇提取物的敏感性低，槐耳醇提取物對細胞的增殖抑制作用弱，提示eIF5A2蛋白可能影響胃癌細胞對槐耳醇提取物的敏感性，且表達越高，槐耳醇提取物對腫瘤的增殖抑制作用越弱。總之，本研究表明eIF5A2蛋白可能與胃癌的形成有關，且其表達量的高低可能影響了胃癌細胞對藥物的敏感性。因此，研究eIF5A2在胃癌中的表達，為臨床提供更多的綜合治療胃癌的方案，判斷臨床預后、提高胃癌患者的生存質量具有重要的臨床意義。eIF5A2也許可作為胃腫瘤一種新的分子診斷或預后的指標，甚至在不久的將來能作為抗腫瘤治療的分子靶點。我們需要一種既能針對耐藥靶基因的，又能與傳統藥物聯合治療以增強傳統化療藥物療效，副作用較輕的藥物，而GC7抑制eIF5A2的hypusination被認為是抑制腫瘤生長的有效途徑。鑒于GC7對胃癌患者的潛在治療可能，本研究結果對于胃癌患者的治療具有重要的生物學意義。槐耳清膏被證明具有促進腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的分裂，逆轉腫瘤細胞的耐藥性等作用，被認為具有良好的抗腫瘤效果和較低的毒副作用，金克顆粒在臨床上用于胃癌、乳腺癌、肝癌等的治療。本次試驗中發現，本中心自主提取的槐耳醇提取物能抑制胃癌細胞增殖，胃癌細胞的存活率隨著槐耳醇提取物濃度的升高而降低。不同eIF5A2表達量的胃癌細胞對槐耳醇提取物的敏感性不同，且eIF5A2表達量高的胃癌細胞對槐耳醇提取物的敏感性低，eIF5A2表達量低的胃癌細胞對槐耳醇提取物的敏感性高，表明eIF5A2的表達量的高低在一定程度上會影響槐耳醇提取物對胃癌細胞的抑制作用。作者發現，胃癌細胞在用槐耳醇提取物處理24h后，其eIF5A2的表達量會升高，表明eIF5A2蛋白可能有助于胃癌細胞抵抗槐耳的作用。本實驗發現GC7對eIF5A2的抑制作用有助于提高槐耳醇提取物對胃癌細胞的增殖抑制作用，GC7顯著增強了胃癌細胞AGS、BGC-823、HGC-27對槐耳醇提取物的敏感性。但是，因以上主要為槐耳醇提取物在抗腫瘤方面的體外實驗研究，其結果可能受藥物本身、離子濃度和滲透壓等因素的影響，因此，下一步還需繼續在動物荷瘤模型中研究，進行體內研究來驗證槐耳醇提取物對胃癌的抗腫瘤效果，促進其以后在臨床上的應用。