百草枯所致肺纖維化患者Ⅱ型肺泡表面抗原6粘糖蛋白與肺泡表面活性蛋白A、D及白介素6的相關性研究

王 英，劉 敏，于波濤，王敬東

百草枯是一種非選擇性接觸型除草劑，因其除草效能高而在我國農業生產中普遍應用。百草枯進入人體后可迅速進入各循環系統并對多種器官造成不同程度損傷［1-2］。肺部是百草枯主要靶器官之一，而肺泡上皮細胞可攝取大量百草枯并蓄積在肺組織，因此肺組織中百草枯濃度是血液的數十倍以上［3］。研究表明，百草枯可通過誘導肺成纖維細胞及肺上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞并導致細胞外基質沉積，造成肺泡壁厚度增加并對肺泡結構產生影響，最終引發肺纖維化［4-5］。目前，臨床上主要采用免疫抑制劑及抗氧化劑治療百草枯所致肺纖維化，但整體治療效果較差［6-8］，因此積極尋找新的治療靶點以提高百草枯所致肺纖維化患者治愈率具有重要臨床意義。本研究旨在探討百草枯所致肺纖維化患者Ⅱ型肺泡表面抗原6（KL-6）粘糖蛋白與肺泡表面活性蛋白A（SP-A）、肺泡表面活性蛋白D（SP-D）及白介素6（IL-6）的相關性，為百草枯所致肺纖維化患者治療靶點研究提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標準 百草枯所致肺纖維化患者早期（3 d～1周）主要表現為肺紋理增多，肺野毛玻璃樣改變甚至雙肺廣泛高密度影，“白肺”形成，肺實質改變或小囊腫等；中期（1～2周）主要表現為肺大片實變，肺泡結節及部分肺纖維化；后期（2周后）主要表現為局限性或彌漫性網狀纖維化、低氧血癥。

1.2 一般資料 選取2016年6月—2017年2月青島市中心醫院收治的百草枯所致肺纖維化患者65例作為觀察組，排除標準：（1）存在免疫缺陷性疾病者；（2）存在惡性腫瘤者；（3）中毒至入院時間＞2 h者；（4）既往有肺、肝、腎等臟器疾病者；（5）臨床資料不完整者；（6）合并其他藥物中毒者；（7）入組前服用過免疫抑制劑、免疫增強劑者。另選取同期在青島市中心醫院體檢健康志愿者30例作為對照組。兩組患者性別、年齡、體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表1），具有可比性。本研究經青島市中心醫院醫學倫理委員會審批通過，所有受試者或其家屬簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較Table1 Comparison of general information between the two groups

1.3 方法

1.3.1 血清KL-6粘糖蛋白水平檢測方法 抽取兩組受試者清晨空腹靜脈血3 ml，4 000 r/min離心10 min（離心半徑13 cm），留取上清液1 ml并置于-20 ℃冰箱保存待測；采用化學發光酶免疫檢測法檢測血清KL-6粘糖蛋白水平，具體如下：將稀釋后血清標本及KL-6粘糖蛋白校準液分注入含KL-6抗體的抗體結合粒子溶液（250 μl），混勻后37 ℃孵育10 min，去除反應液、洗凈后加入堿性磷酸酶標記抗體250 μl，37 ℃孵育10 min，再次去除反應液、洗凈后加入底物200 μl，混勻后37 ℃反應5 min，測定波長477 nm處發光強度最大條帶即為血清KL-6粘糖蛋白水平。KL-6粘糖蛋白試劑盒購自富士瑞必歐株式會社并嚴格按照說明書進行操作，所用儀器為LUMI PULSE G1200全自動免疫分析儀，并設置復孔取均值。

1.3.2 血清SP-A、SP-D、IL-6水平檢測方法 抽取兩組受試者清晨空腹靜脈血3 ml，3 500 r/min離心10 min（離心半徑13 cm），留取上清液1 ml并置于-80 ℃冰箱保存待測；采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清SP-A、SP-D、IL-6水平，具體如下：首先將抗人SP-A抗體包被于酶標板上，標準品或血清標本中SP-A與包被抗體結合后洗去游離成分，按順序加入生物素化的抗人SP-A抗體及辣根過氧化物酶標記的親和素，抗人SP-A抗體與結合在包被抗體上的人SP-A結合后形成免疫復合物，洗去游離成分并加入顯色底物，在辣根過氧化物酶的催化下顯色底物變為藍色，加入終止液后顯色底物變為黃色，采用酶標儀測定450 nm波長處光密度（OD）值并通過繪制標準曲線計算血清SP-A水平。血清SP-D、IL-6水平檢測原理、步驟及計算方法同血清SP-A水平，試劑盒均購自伊萊瑞特生物科技有限公司并嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料分析采用χ2檢驗；百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白水平與血清SP-A、SP-D、IL-6水平的相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平觀察組患者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.2 相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白水平與血清SP-A（r=0.573）、SP-D（r=0.466）、IL-6（r=0.521）水平均呈正相關（P＜0.05）。

表2 兩組受試者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平比較Table2 Comparison of serum levels of KL-6 mucoprotein，SP-A，SP-D and IL-6 between the two groups

表2 兩組受試者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平比較Table2 Comparison of serum levels of KL-6 mucoprotein，SP-A，SP-D and IL-6 between the two groups

注：KL-6=Ⅱ型肺泡表面抗原6，SP-A=肺泡表面活性蛋白A，SP-D=肺泡表面活性蛋白D，IL-6=白介素6

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3 討論

百草枯中毒可累及多個臟器，嚴重時可導致多器官功能障礙綜合征（MODS）。肺臟是百草枯主要靶器官之一，百草枯中毒后可形成“百草枯肺”，早期表現為急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），后期則出現肺泡內和肺間質纖維化，而百草枯所致肺纖維化患者病死率為50%～70%［9-10］。肺出血、水腫、肺部間質炎癥、膠原合成及成纖維細胞增殖是百草枯所致肺纖維化的主要病理特征［11］，但目前百草枯導致肺纖維化的具體機制尚不完全明確，氧自由基造成的直接損傷及成纖維細胞、炎性細胞造成的間接損傷可能是百草枯導致肺纖維化的主要原因［12］。

KL-6粘糖蛋白分子量較大，是黏蛋白1（MUC1）家族成員之一［13］。KL-6粘糖蛋白主要在Ⅱ型肺泡上皮、胰腺及乳腺導管組織中表達，其中Ⅱ型肺泡上皮中KL-6粘糖蛋白表達水平較高。研究表明，KL-6粘糖蛋白可促進成纖維細胞產生膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ并誘導成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，促進α平滑肌肌動蛋白生成及上皮-間質轉變，誘導大量細胞外基質成分產生［14-15］；KL-6粘糖蛋白對特發性肺纖維化有一定診斷價值并可在一定程度上判斷疾病的嚴重程度［16］，但目前關于百草枯中毒所致肺纖維化患者KL-6粘糖蛋白的臨床意義研究較少見。本研究結果顯示，觀察組患者血清KL-6粘糖蛋白水平高于對照組，提示血清KL-6粘糖蛋白水平可作為診斷百草枯所致肺纖維的參考指標，分析百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白水平升高機制如下：百草枯中毒導致基底膜損傷及Ⅱ型肺泡上皮細胞含量增加，KL-6粘糖蛋白分泌隨之增多并釋放入肺泡襯褶，肺泡襯褶損傷及血管通透性增加導致KL-6粘糖蛋白釋放入血而引起血清中KL-6粘糖蛋白水平升高［17-19］。

肺泡表面活性蛋白屬親水性大分子物質，主要來源于肺泡Ⅱ型上皮細胞，包括A、B、D等多種亞型，其中SP-A、SP-D表達量占該類蛋白總表達量的一半以上［20］。正常情況下，SP-A、SP-D無法通過肺組織血氣屏障而進入血液循環，因此健康人血清SP-A、SP-D水平較低。既往研究表明，肺纖維化大鼠血清白介素4（IL-4）及SP-A水平明顯高于正常大鼠，且肺纖維化程度越重，血清IL-4及SP-A水平越高［21-22］；不同階段肺纖維化大鼠血清SP-D水平均高于正常大鼠，且血清SP-D水平隨肺纖維化程度加重而升高［16，22-23］。本研究結果顯示，觀察組患者血清SP-A、SP-D水平高于對照組，與上述研究結果一致，分析其主要原因與肺泡Ⅱ型上皮細胞分泌肺泡表面活性蛋白增多、肺組織血氣屏障遭破壞而導致SP-A、SP-D進入血液循環有關。

有研究表明，百草枯進入體內后可通過脂質過氧化物損傷組織細胞并引發應激反應，刺激白介素1（IL-1）、IL-6及腫瘤壞死因子α等炎性遞質大量釋放，繼而導致巨噬細胞、中性粒細胞等浸潤、聚集并進一步促進炎性遞質及細胞因子釋放，造成組織損傷加重［24-26］。IL-6主要由血管內皮細胞及單核細胞分泌產生，具有廣泛的生物學效應，血清IL-6水平升高不僅會對血管內皮細胞造成直接損傷，還可能催化、放大炎性反應并進一步加重血管內皮細胞。本研究結果顯示，觀察組患者血清IL-6水平高于對照組，分析原因可能與百草枯導致肺纖維化過程中大量增生的巨噬細胞、淋巴細胞、成纖維細胞分泌大量IL-6有關［27-28］。本研究結果還顯示，百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白水平與血清SP-A、SP-D、IL-6水平均呈正相關，提示KL-6粘糖蛋白可作為診斷百草枯所致肺纖維化的參考指標，這也為百草枯所致肺纖維化的治療提供了新的靶點。

綜上所述，百草枯所致肺纖維化患者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平明顯升高，且血清KL-6粘糖蛋白水平與血清SP-A、SP-D、IL-6水平呈正相關，KL-6粘糖蛋白可作為診斷百草枯所致肺纖維化的參考指標及治療靶點；但本研究樣本量較小且觀察指標較少，結果結論尚需擴大樣本量進一步研究證實。

作者貢獻：王英進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責；劉敏、于波濤進行試驗實施、評估、資料收集；王敬東進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。