RECQL4基因在肺癌組織中表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

張潔 張培先 鄧?yán)?王以

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院（昆明 650051）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一［1］。盡管近年來，手術(shù)、化療等治療的技術(shù)手段日益完善，但仍有超過60%的肺癌患者是在腫瘤的晚期才被發(fā)現(xiàn)［2］。近年來我國在肺癌診斷和輔助治療方面也取得了很大進(jìn)展，但由于環(huán)境和經(jīng)濟(jì)發(fā)展等眾多因素的作用，肺癌發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢，且患者的預(yù)后情況非常差，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量［3］。因此，臨床上進(jìn)一步探索新的、有價值的診斷及預(yù)后標(biāo)志物，對進(jìn)一步提高我國肺癌的診治和評估能力具有重要意義。

RECQL4是一種ATP依賴的解旋酶，屬于RECQ家族一員。研究發(fā)現(xiàn)RECQL4的突變能夠?qū)е律窠?jīng)退行性疾病Rothmund?Thomson綜合癥［4-6］，其主要的功能是參與DNA的復(fù)制和雙鏈斷裂的修復(fù)［7-8］。眾所周知，腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一就是高頻率的細(xì)胞復(fù)制，有文獻(xiàn)報道DNA復(fù)制和修復(fù)酶參與了腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和化療耐藥，提示該類分子在腫瘤的發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用［9-12］。然而，目前RECQL4基因在腫瘤中作用和機(jī)制研究還未見報道。

本研究采用組織芯片結(jié)合免疫組織化學(xué)的方法和關(guān)聯(lián)分析，研究了97例肺癌患者RECQL4表達(dá)與病理資料及臨床預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

RECQL4 Forward RECQL4 Reverse β?actin Forward β?actin Reverse 5′?AGTGACGACCAGAGCCAGAC?3′5′?CCTTAGCCCACACCATGAAA?3′5′?CCACGAAACTACCTTCAACTCC?3′5′?GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT?3′

1.1材料本實(shí)驗(yàn)的研究對象是肺癌的手術(shù)標(biāo)本，10例正常組織、30例肺癌以及97例帶有臨床特征資料的肺癌組織樣本均來自我院腫瘤科，其中97例帶有臨床特征資料的肺癌患者于2002年1月至2009年3月接受手術(shù)治療的部分肺癌患者。本研究是由我院倫理委員會批準(zhǔn)，招募患者均簽署了知情同意書。

本研究中應(yīng)用的肺癌細(xì)胞株A549和LTEP從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫進(jìn)行購買，細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清（Giboco）的RPMI 1640（Hyclone）和F12K（Invitrogen）培養(yǎng)基，于5%CO2和溫度為37 ℃的細(xì)胞孵育箱。

1.2方法

1.2.1RT?PCR與RT?qPCR采用液氮研磨和經(jīng)典Trizol法提取凍存組織的總RNA，測定OD260/OD280值，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后儲存在-20℃冰箱待用。RT?PCR產(chǎn)物使用2.5%的瓊脂糖膠進(jìn)行電泳檢測，RT?qPCR使用伯樂道德CFX型號熒光定量儀器測定，結(jié)果分析使用2?ΔΔCT法計(jì)算。RECQL4和β?actin基因的引物如下：

1.2.2免疫組化RECQL4抗體購買于Abcam公司（ab155402）。免疫組化操作參考已發(fā)表論文［13］。一抗按1∶150稀釋，免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性率的乘積進(jìn)行表達(dá)水平定量：染色陽性率≤5%記為0分，5%到25%記為1分，26%到50%記為2分，51%到75%記為3分，＞76%記為4分；染色強(qiáng)度分為陰性為0分，弱陽性為1分，中陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分。根據(jù)平均表達(dá)值，0～7分的患者判定為低表達(dá)組，8～12分的患者判定為高表達(dá)組。

1.2.3公共數(shù)據(jù)庫分析大樣本表達(dá)驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析使用 TCGA數(shù)據(jù)庫（www.genome?cancer.ucsc.edu/proj/site/hgHeatmap/TCGA Lung cancer（LUNG）gene expression by RNAseq（IlluminaHiSeq）·N=1124）。生存期分析使用KM plotter（http：//km?plot.com/analysis）在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。分析采用自動選擇最佳劃界值（cutoff）；RECQL4探針為213520_at。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。當(dāng)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有：（1）t檢驗(yàn)；（2）χ2檢驗(yàn)；（3）Kaplan?meier生存曲線。

2 結(jié)果

2.1RECQL4基因在肺癌組織中的表達(dá)情況RT?PCR結(jié)果顯示，肺癌組織中RECQL4的表達(dá)高于正常肺組織的表達(dá)水平（圖1A）。RT?qPCR結(jié)果表明，RECQL4在肺癌組織中的表達(dá)（2.891±0.081 1）也顯著高于正常肺組織（1.431±0.210 3，P＜0.001）（圖1B）。筆者使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，上述結(jié)果在大樣本肺癌病人中得到了驗(yàn)證（圖1C）。進(jìn)一步采用免疫組化方法在蛋白水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，RECQL4蛋白在肺癌組織中的表達(dá)高于在癌旁組織的表達(dá)（圖2）。這些結(jié)果說明，RECQL4基因在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常或癌旁組織，提示其可能參與肺癌的發(fā)生和發(fā)展。

2.2RECQL4表達(dá)與肺癌患者臨床參數(shù)關(guān)系分析為了研究RECQL4表達(dá)與肺癌患者臨床參數(shù)的關(guān)系，本研究通過免疫組化分析了含有97例肺癌患者的組織芯片中RECQL4的表達(dá)。通過染色強(qiáng)度和陽性率進(jìn)行定量RECQL4表達(dá)后，與肺癌患者性別、年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示，RECQL4表達(dá)與肺癌患者的臨床分期（P=0.011），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.026）和腫瘤大小（P=0.037）顯著相關(guān)，而與患者的年齡（P=0.429）和性別（P=0.279）不相關(guān)（表1）。

2.3RECQL4表達(dá)與肺癌患者預(yù)后關(guān)系分析為探究RECQL4表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系，筆者使用公共數(shù)據(jù)庫KM plotter分析了RECQL4表達(dá)對患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示對于肺癌患者總生存期，RECQL4高表達(dá)是一個不良的預(yù)后指標(biāo)（P＜0.001，n=1145，圖3A）。為了分析RECQL4表達(dá)在肺腺癌和肺鱗癌患者預(yù)后中的意義是否存在差別，我們使用公共數(shù)據(jù)庫KM plotter將肺腺癌和肺鱗癌分開后分別進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RECQL4表達(dá)在肺腺癌患者總生存期（P＜0.001，n=673）中是一個不利因素（圖3B）。而在肺鱗癌中REC?QL4表達(dá)對患者總生存期并沒有影響（P=0.24，n=271，圖3C）。提示RECQL4表達(dá)在肺腺癌是一個不利預(yù)后因素。

圖1 RECQL4基因在肺癌（T）和正常組織（N）中mRNA水平表達(dá)Fig.1 The mRNA expression status of RECQL4 in Lung cancer（T）and normal tissues（N）

圖2 通過免疫組化分析RECQL4蛋白在肺癌和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of RECQL4 gene in lung cancer and adjacent tumor tissues detected by IHC

2.4 RECQL4基因在肺癌中功能的初步研究為了確定RECQL4基因在肺癌中是否具有功能，本研究在肺癌細(xì)胞株中對該基因表達(dá)進(jìn)行干擾（轉(zhuǎn)染用siRNA購自Santa Cruz公司，sc?38219），通過MTS實(shí)驗(yàn)檢測干擾RECQL4基因表達(dá)后對腫瘤細(xì)胞生長及增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾RECQL4基因表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞生長和增殖受到了明顯的抑制作用（圖4A～C）。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RECQL4基因具有顯著的腫瘤生長促進(jìn)功能，是一個潛在的癌基因。

表1 在97例肺腺癌組織中RECQL4表達(dá)與病人臨床特征之間的關(guān)系Tab.1 The relationship between RECQL4 expression and clinical characteristics in 97 adenocarcinoma patients 例

圖3 RECQL4基因表達(dá)與肺癌病人總生存期之間的關(guān)系Fig.3 The relationship between RECQL4 expression and Overall Survival（OS）of Lung cancer patients.

圖4 通過MTS實(shí)驗(yàn)分析RECQL4基因?qū)549和LTEP腫瘤細(xì)胞增殖的影響Fig.4 MTS assay was used to examine the effect of RECQL4 on proliferation of A549 and LTEP cells

3 討論

在腫瘤細(xì)胞中DNA高頻的復(fù)制需要大量參與復(fù)制的酶，同時復(fù)制產(chǎn)生的錯配也需要大量修復(fù)酶進(jìn)行及時修復(fù)［14-15］。RECQL4作為一種ATP依賴的解旋酶主要參與了DNA的復(fù)制和雙鏈斷裂的修復(fù)［7-8］，這意味著RECQL4在腫瘤形成過程中可能具有非常重要的作用。我們的研究結(jié)果顯示，相對于正常或癌旁肺組織RECQL4在肺癌組織中的表達(dá)明顯升高，提示RECQL4在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能具有極其重要的功能。

為探究RECQL4對肺癌患者的臨床意義，我們分析了97例肺癌患者RECQL4表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RECQL4表達(dá)與肺癌患者的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小顯著相關(guān)。RECQL4在臨床晚期（Ⅲ+Ⅳ，46.51%，20/43）中的高表達(dá)比例明顯高于在臨床早期（Ⅰ+Ⅱ，22.22%，12/54）中的高表達(dá)比例，而且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為陽性和腫瘤越大時RECQL4高表達(dá)比例越高（表1）。這些結(jié)果預(yù)示RECQL4在肺癌中很可能是一個癌基因，且可能與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行初步功能分析發(fā)現(xiàn)，RECQL4基因能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。下一步我們將對RECQL4基因是否影響腫瘤的轉(zhuǎn)移進(jìn)行功能性研究。

細(xì)胞的增殖能力主要取決于兩個主要事件：細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。本研究中發(fā)現(xiàn)RECQL4能夠明顯加速腫瘤細(xì)胞的增殖，那就意味著腫瘤細(xì)胞凋亡的減少或細(xì)胞周期的加快，抑或兩者兼有。RECQL4是一個DNA螺旋酶，主要影響基因組的穩(wěn)定性和完整性，參與DNA的復(fù)制和雙鏈斷裂。綜合以上，RECQL4影響腫瘤細(xì)胞增殖很可能與存在DNA復(fù)制及斷裂的細(xì)胞周期相關(guān)。因此，我們的下一步研究的焦點(diǎn)是確定RECQL4加速腫瘤細(xì)胞增殖的主要原因（主要影響細(xì)胞周期還是細(xì)胞凋亡），以及可能的下游分子和信號級聯(lián)通路。

通過進(jìn)一步分析RECQL4表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，RECQL4低表達(dá)的患者預(yù)后情況顯著優(yōu)于高表達(dá)患者。這一結(jié)果暗示，RECQL4可以作為準(zhǔn)確預(yù)測病人預(yù)后的一個潛在標(biāo)記物。為了確定RECQL4的預(yù)后意義在肺癌的兩個主要類型即肺腺癌和肺鱗癌患者中是否存在不同，我們通過數(shù)據(jù)庫將肺腺癌和肺鱗癌患者分開分別進(jìn)行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，RECQL4表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后關(guān)系密切，而與肺鱗癌患者預(yù)后不相關(guān)。前期已有報道發(fā)現(xiàn)，SOX30在肺腺癌和肺鱗癌中預(yù)后意義存在不同，而且這種不同是由于該基因在兩類肺癌類型中的功能存在明顯差異［16］。那么，RECQL4表達(dá)在肺腺癌和肺鱗癌中的不同預(yù)后意義是否也存在功能上的不同目前還不得而知，還需要以后進(jìn)一步的深入研究。

本研究的創(chuàng)新之處是在肺癌中發(fā)現(xiàn)了一個新的特異性預(yù)后評估指標(biāo)和功能基因，該結(jié)果對肺癌尤其是肺腺癌患者的準(zhǔn)確預(yù)后評估具有重要的指導(dǎo)意義，并為進(jìn)一步明確肺癌的發(fā)病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

本研究的不足之處在于肺癌樣本量不足，以至于缺少肺鱗癌患者中RECQL4表達(dá)與臨床特征資料之間的關(guān)系分析。我們下一步將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并增加除肺腺癌和肺鱗癌外的其他肺癌類型患者如小細(xì)胞肺癌等的樣本，探究RECQL4表達(dá)在其他類型肺癌患者中的臨床和預(yù)后意義，并分析不同類型肺癌患者中RECQL4臨床和預(yù)后意義是否存在不同。進(jìn)一步探索RECQL4基因在不同類型肺癌中是否存在功能及具體分子機(jī)制的不同。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在肺癌中REC?QL4的表達(dá)顯著高于正常或癌旁組織，且其表達(dá)與患者的臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小有關(guān)密切。初步功能分析發(fā)現(xiàn)，RECQL4基因能夠明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，是一個重要候選癌基因。預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，RECQL4低表達(dá)肺腺癌患者預(yù)后顯著優(yōu)于高表達(dá)肺腺癌患者，顯示RECQL4是一個有潛在的具臨床應(yīng)用價值的生物標(biāo)志物。而且，RECQL4表達(dá)只在肺腺癌患者總生存期中是一個不利因素，而在肺鱗癌中與患者生存沒有關(guān)系。