氧化應激誘導代謝綜合征大鼠勃起功能障礙的機制研究*

李 瑞 劉 康 李 浩 張 巖 陳 智 袁彗星 李明超 王 濤 藍儒竹 劉繼紅 饒 可

華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院泌尿外科（武漢 430030）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）影響著全世界5%～20%的成年男性，其致病因素較多，包括精神因素、心血管疾病、盆腔手術以及代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）等[1]。隨著飲食習慣和生活方式的改變，MetS病人越來越多，由MetS導致的ED（metabolic syndrome related erectile dysfunction，MED）也受到越來越多的關注。MetS不是一種特定的疾病，而是指體內物質代謝紊亂而造成的一系列綜合征，以胰島素抵抗為中心，常表現為腹型肥胖、高血壓、高血脂、高血糖中的至少3種[2]。MetS在不同種族人群中的發病率為20%～40%，且隨著年齡的增加而升高[3]。MetS是一種復雜的全身代謝性疾病，其組成要素腹型肥胖、高血壓、高血脂、高血糖均是ED的危險因素，這幾種危險因素累加，引起ED的風險更大[4]。研究發現，MetS病人患ED的概率是普通人的兩倍，且ED的癥狀更嚴重，并對5型磷酸二酯酶抑制劑（phosphodiesterase type 5 inhibitors，PDE5i）反應不佳[5,6]。因此，研究MED的致病機制可能會為這些病人的治療探索新的靶點，并為臨床診治提供新的策略。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指氧自由基和氧化作用較強的非自由基含氧產物，是生物有氧代謝過程中的一種副產品。ROS主要是由氧產生，包括超氧陰離子、氫氧根離子、過氧化氫、一氧化氮、羥自由基等[7]。機體有多種酶參與活性氧的生成，包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶、線粒體呼吸鏈復合酶、黃嘌呤氧化酶、細胞色素P450、一氧化氮合成酶等，其中NADPH氧化酶是體內活性氧生成的重要來源。NADPH氧化酶是一種輔酶，也叫還原型輔酶Ⅱ，由p22phox、p40phox、p47phox、p67phox、gp91phox和GTP酶Rac構成的復合體。我們在前期研究中發現，在去勢大鼠陰莖海綿體組織中，活性氧水平增高，導致氧化應激水平增加，引起內皮細胞功能障礙，cGMP產生減少，導致ED發生[8]。另有研究發現在糖尿病、高脂血癥、老齡和高尿酸血癥性ED病理過程中，體內ROS產生增多，氧化應激水平增高，引起內皮細胞功能障礙，NO生成和釋放減少，cGMP含量降低，最終導致ED[9-13]。但在MED大鼠模型中，相關研究較少。

本研究通過喂養法建立MED大鼠模型，研究MED大鼠陰莖海綿體組織中氧化應激水平的變化，探討氧化應激導致MED的機制。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

3周齡健康雄性SD大鼠40 只，購于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。

（二）藥物及試劑

高脂高糖飼料（D12492，北京華阜康生物科技股份有限公司），胰島素測定試劑盒、膽固醇測定試劑盒、甘油三脂測定試劑盒、高密度脂蛋白測定試劑盒、低密度脂蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），RIPA 裂解液（江蘇碧云天生物技術研究所），蛋白酶抑制劑Cocktail（美國羅氏公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所），gp91phox抗體（武漢三鷹生物技術有限公司），eNOS抗體（美國Abcam公司），DHE試劑盒（威格拉斯生物技術（北京）有限公司），cGMP試劑盒（南京建成生物工程研究所），ECL試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所）。

（三）主要儀器

Powerlab四通道生理記錄儀（澳大利亞AD Instruments公司）。

二、方法

（一）MED模型建立

將40只3周齡雄性SD大鼠適應性喂養1周后隨機分為2組，正常對照組10只，喂普通飼料；實驗組30只，喂高脂高糖飼料（D12492），喂養時間為6個月。

（二）MED模型建立及海綿體測壓

喂養6個月后檢測大鼠的體質量、無創血壓計檢測大鼠血壓、血糖儀檢測空腹血糖、尾靜脈取血檢測大鼠血漿胰島素濃度和血脂等代謝參數。篩選出MetS大鼠后進行阿撲嗎啡（apomorphine，APO）試驗，APO按100μg/kg皮下注射，給藥后于陰暗環境中觀察，以大鼠陰莖體增長、露出作為勃起功能良好的標志，即APO（+）；反之則為APO（-）。APO（-）大鼠即為篩選出的MED大鼠。大鼠測體質量后腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉（40mg/kg）進行麻醉，麻醉完全后依次剪開大鼠頸部正中皮膚、筋膜、肌肉，暴露一側頸總動脈。仔細游離與頸總動脈緊密相連的迷走神經，并用絲線結扎頸總動脈遠心端，近心端使用動脈夾夾閉。將充滿肝素生理鹽水的PE-50管與Powerlab/4SP數據采集分析系統連接。在顯微鏡下用顯微剪剪開頸總動脈，將PE-50管插入頸總動脈，絲線結扎固定PE-50管。移除近心端動脈夾，Powerlab/4SP數據采集分析系統收集大鼠血壓信息。沿腹部正中線剪開腹部皮膚、腹壁肌肉，分離盆腔內前列腺與周圍組織。找到位于前列腺后外側的膨大的盆神經節，其中由盆神經節發出的較大的分支且向陰莖方向斜行走行的即為海綿體神經。鑷子牽拉陰莖，剪開陰莖皮膚及皮下筋膜，充分暴露陰莖海綿體。將25 G靜脈輸液針與Powerlab/4SP 數據采集分析系統連接，使用肝素生理鹽水沖洗導管。將輸液針針頭插入一側陰莖海綿體內，調整陰莖海綿體內的針頭，使其與海綿竇連接通暢。打開Powerlab/4SP 數據采集分析系統的電刺激選項，將刺激參數調為15 Hz、1.2 ms，采用5.0 V電壓刺激海綿體神經，持續時間為1min，刺激間隔為10min。測壓完畢后，注射過量空氣處死大鼠。收集陰莖海綿體組織，PBS沖洗后平均分為三段，將中段海綿體制備冰凍切片，其余兩段放至-80℃冰箱保存。

（三）Western blot 檢測陰莖海綿體組織中gp91phox和eNOS蛋白表達

將大鼠陰莖海綿體100mg剪碎后加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑Cocktail，用超聲破碎蛋白。然后4℃離心機中12 000×g離心10min，取上清，用BCA法測定蛋白濃度后取總蛋白量40μg，100℃煮沸10min。配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白。電泳結束后將蛋白轉到PVDF 膜上，然后使用5%的BSA 封閉 PVDF膜2h，封閉后放入gp91phox（1：200）, eNOS（1：1000）抗體中孵育過夜。取出后洗膜3次，每次 10min，然后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔和羊抗小鼠二抗（1：5000）繼續孵育1h。孵育完成后再次洗膜30 min，采用 ECL 化學發光并采集圖像進行處理，用 Quantity One 軟件分析圖像。

（四）陰莖海綿體組織活性氧水平檢測

將大鼠陰莖海綿體組織制備成8mm厚的冰凍切片，并將冰凍切片放至室溫平衡。配制濃度為1μmol/L的二氫乙啶溶液，冰凍切片避光添加二氫乙啶溶液，37℃溫箱中避光孵育30min，孵育結束后用PBS清洗玻片。倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，隨后采用Image-Pro Plus軟件進行定量分析。

（五）陰莖海綿體組織cGMP濃度檢測

陰莖海綿體組織放入勻漿器，置于冰上，加400μL RIPA裂解液（含PMSF和Cooktail）于勻漿器中快速勻漿10min，磨碎組織，冰上裂解30min后，用移液器將裂解混合物轉移至1.5 mL離心管中，4℃下12 000×g離心10min。提取的蛋白裂解液按照說明書檢測陰莖海綿體組織cGMP濃度。

三、統計學方法

結 果

一、兩組大鼠代謝參數比較

MED組大鼠接受高脂高糖飼料喂養6個月后，體質量、空腹血糖、血膽固醇、血胰島素明顯高于正常對照組（表1）。

表1 兩組大鼠代謝參數

二、兩組大鼠Max ICP/MAP比較

用5.0V電壓刺激對照組大鼠陰莖海綿體神經后，Max陰莖海綿體內壓（ICP）/平均動脈壓（MAP）為0.75±0.04，用5.0V電壓刺激MED組大鼠陰莖海綿體神經后，Max ICP/MAP為0.46±0.05。MED組大鼠Max ICP/MAP明顯低于正常對照組，P＜0.05（圖1）。

圖1 兩組大鼠勃起功能檢測

三、兩組大鼠陰莖海綿體組織中活性氧水平比較

MED組大鼠陰莖海綿體組織中活性氧水平明顯高于正常對照組，氧化應激水平明顯增加（圖2A，圖2B）。

四、兩組大鼠陰莖海綿體組織gp91phox蛋白表達比較

五、兩組大鼠陰莖海綿體組織eNOS蛋白表達和cGMP濃度比較

MED組大鼠陰莖海綿體組織中eNOS表達明顯低于正常對照組，cGMP濃度也明顯低于正常對照組（P＜0.05）（圖3）。

圖2 兩組大鼠陰莖海綿體組織中氧化應激水平

圖3 兩組大鼠陰莖海綿體組織中eNOS蛋白表達水平和cGMP濃度

討 論

目前認為MetS導致ED主要包括以下幾個機制[14]：（1）陰莖局部的氧化應激；（2）陰莖海綿體內皮功能障礙；（3）陰莖血管的損害；（4）性腺功能減退；（5）持續的高血糖狀態使泌尿生殖系統感覺神經發生病變，影響傳遞到陰莖的神經遞質[如神經源型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）]釋放減少；（6）胰島素抵抗引起陰莖平滑肌對舒血管物質的反應性下降和陰莖局部縮血管物質的釋放增加；（7）治療MetS的某些藥物（如β-受體阻滯劑等）可能影響陰莖勃起；（8）病變晚期陰莖海綿體組織纖維化。本研究把焦點集中在MetS病理條件下，陰莖組織中氧化應激是否發生變化，發生怎樣的變化?

生理水平的活性氧對于維持機體正常的生理功能具有重要意義，然而當活性氧過多積聚，超過抗氧化酶系統的清除能力，就會產生氧化應激，對機體造成氧化損傷。ROS在體內無處不在，他的產生可能是病理的或生理的，取決于各種情況。線粒體電子傳遞系統和NADPH氧化酶是ROS最常見的來源，而細胞色素P450和內皮型一氧化氮合酶（eNOS）以及髓過氧化物酶是一些能產生這些活性自由基的其他來源。其中NADPH氧化酶是內皮細胞中ROS的主要來源。Glennon-Alty等研究發現在自身免疫性疾病中NADPH氧化酶被激活，產生大量的超氧自由基和過氧化氫，導致ROS水平增高，從而引起一系列氧化損傷[15]。Manea等研究發現，在糖尿病病理過程中，組蛋白去乙?；改苌险{NADPH氧化酶亞基的蛋白表達，進一步增加活性氧水平，降低NADPH氧化酶亞基的蛋白表達后，活性氧水平降低[16]。Yin等研究發現在糖尿病ED小鼠陰莖組織中，P47phox激活，使NADPH氧化酶活性增強，導致ROS過量增加[17]。我們研究發現在MED大鼠陰莖海綿體組織中NADPH氧化酶亞基gp91phox表達增高，DHE染色顯示ROS產生增多。這表明ROS產生增多可能是由gp91phox表達增高，NADPH氧化酶活性增強導致。

近來有研究報道在門靜脈高壓大鼠的腸系膜內皮細胞中NADPH氧化酶被激活后產生過量的ROS，引起內皮細胞功能障礙，給予抗氧化劑治療后能降低ROS水平，改善內皮細胞功能[18]，另有研究發現在糖尿病模型中NADPH氧化酶被激活，引起ROS產生增多，導致氧化損傷，進一步損害內皮功能[19]。在正常情況下，機體通過氧化和抗氧化機制使體內ROS的生成和清除達到動態平衡，使ROS保持在正常水平。Huang等研究發現在吸煙誘導ED的大鼠模型中，大鼠陰莖組織中ROS水平明顯增高，導致陰莖組織的凋亡明顯增強，陰莖平滑肌數量明顯減少，陰莖內皮的完整性也受到破壞，導致內皮功能障礙，最終導致ED的發生[20]。同樣在老齡性ED，高脂血癥性ED和高尿酸血癥性ED中都發現有ROS產生增多，損害內皮細胞功能和NO/cGMP信號通路，最終導致ED[9,12,13]。然而，在MED病理過程中ROS對陰莖海綿體內皮功能的作用還不得而知。我們研究發現在MED大鼠陰莖海綿體中NADPH氧化酶亞基gp91phox表達增高，DHE染色顯示ROS產生增多，eNOS和cGMP表達下調。因此ROS過量產生損害內皮功能可能是MED的重要機制。

綜上所述，MetS可能通過激活陰莖海綿體NADPH氧化酶活性，上調陰莖海綿體平滑肌組織中活性氧的表達，引起氧化損傷，損害內皮細胞功能，最終導致ED的發生。