白皮杉醇對早期糖尿病腎病大鼠腎臟的影響研究*

吳榮艷 劉德慧 何勇 譚菲 王麗芳 劉宏明 何燕琴

糖尿病腎病（DN）是臨床上常見的糖尿病并發癥之一，隨著該病的發病率逐年上升，已經嚴重危害到人類的健康[1-2]。該病早期無明顯癥狀，患者可以無任何不適癥狀，但當發展到終末期腎臟病時，由于其存在復雜的代謝紊亂，因此往往會比其他的腎臟疾病更難以治療，最終導致患者死亡[3-5]。糖尿病腎病初期病理表現為腎小球高濾過和腎臟肥大，基底膜（GBM）增厚，系膜區基質增多，隨后腎臟出現腎小球結節樣病變與小動脈玻璃樣變，最終發展為終末期腎衰竭[6-7]。其主要特征為腎小球高濾過、高灌注狀態以及出現濾過屏障障礙[8]。白皮杉醇是白藜蘆醇的羥基化類似物，是一種在葡萄、甘蔗等植物中發現的多酚化合物[9]。據相關研究報道，白皮杉醇有抗氧化、清除氧自由基的作用，因而能夠抗衰老、抗菌抗炎并且提高機體的免疫調節力[10-11]，亦有國外學者發現，白藜蘆醇及其類構物能夠改善被脂多糖影響的腎血流動力學指標，其作用機制為下調血漿與尿液中NO的含量，從而抵抗脂多糖導致的腎臟損傷[12]。本研究通過建立糖尿病腎病大鼠模型，擬探討白皮杉醇對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康Wistar大鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司）50只，雌雄各半，適應性喂養1周，飼養于恒溫恒濕環境中，正常進食飲水。

1.2 實驗試劑 鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）；白皮杉醇（杭州唯鉑萊生物科技有限公司）；肌酐測試盒與尿素氮測試盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.3 動物分組 按照隨機數字表法將大鼠分為五組，正常對照組（A組）、模型組（B組）、白皮杉醇低劑量組（C組）、中劑量組（D組）和高劑量組（E組），各10只。

1.4 模型建立及給藥 適應性喂養后，正常對照組大鼠給予普通飼料進行喂養；其余各組給予高脂高糖飼料喂養1周，禁食12 h后采用無菌枸櫞酸鈉緩沖液配置的42 mg/kg鏈脲佐菌素（STZ）進行腹腔注射，72 h后取尾靜脈血進行血糖檢測，以血糖值≥16.7 mmol/L時為造模成功。造模成功后，對白皮杉醇低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠分別采用20、40、60 mg/kg白皮杉醇進行灌胃，1次/d，共給藥4周。模型組與正常對照組給予等量生理鹽水，其余同上。

1.5 樣本收集 上述步驟完成后，各組大鼠禁食不禁水24 h，置于代謝籠中收集尿液，離心備用；之后對大鼠進行腹腔注射麻醉，穿刺腹主動脈，將采集到的血液置于抗凝真空采血管中，靜置1 h后于3 000 r/min離心機中離心10 min，取上清液備用；穿刺取血后，摘取大鼠雙側腎臟，清洗后右側腎臟切取皮髓交界處組織備用，左側腎臟使用4%多聚甲醛固定備用。

1.6 觀察指標 以大鼠的空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）與肌酐（Scr）、尿微量白蛋白（U-mAlb）含量作為觀察指標。FGB含量采用血糖儀檢測；BUN與Scr含量分別采用脲酶-谷氨酸脫氫酶法與肌苷酸氧化酶法檢測；U-mAlb含量采用免疫透射比濁法檢測。

1.7 HE染色病理學觀察 制作腎臟組織石蠟切片，于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中浸泡20 min、梯度乙醇中浸泡5 min，蒸餾水沖洗后再置于蘇木素染液中浸泡2 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化20 s，水洗，用0.5%伊紅液染色1 min，最后置于梯度乙醇中進行脫水、二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中透明。中性樹膠封固后，于顯微鏡下觀察。

1.8 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x-±s）表示，對計量資料進行分析，單因素方差分析采用one-way ANOVA，組間比較采用Benferroni校正。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的FBG、血清BUN及Scr含量變化比較 A組正常飲食，精神狀態正常；B組出現多飲、多食、多尿的癥狀，體重減輕且精神狀態萎靡，FBG、血清BUN含量均明顯高于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。C、D和E組經過藥物干預后，雖“三多”癥狀有所緩解，FBG、血清BUN含量均明顯低于B組，但均明顯高于A組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組間血清Scr含量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠的FBG、BUN及Scr含量變化比較（x-±s）

2.2 各組大鼠的U-mAlb含量變化比較 經檢測，A組的U-mAlb含量為（1.12±0.09）mg/h，B組為（4.05±0.24）mg/h，C 組為（3.67±0.19）mg/h，D 組為（3.23±0.21）mg/h，E 組 為（2.51±0.18）mg/h。B組的U-mAlb含量明顯高于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）。C、D、E組的U-mAlb含量均明顯低于B組，但均明顯高于A組，且其含量隨藥物劑量的增加而逐漸下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組間的U-mAlb含量比較，差異均有統計學意義（F=37.462，P＜0.05）。

2.3 各組大鼠的腎臟病理學觀察 A組腎臟未出現明顯的病理學變化（圖1）；B組腎小管上皮細胞呈空泡樣變性，且出現系膜細胞與基質增生（圖2）；C、D和E組大鼠腎臟病理學變化明顯減輕，其中E組腎臟病理學形態與A組最為接近（圖 3～5）。

圖1 A組大鼠的腎臟病理學觀察（HE，×200）

圖2 B組大鼠的腎臟病理學觀察（HE， ×200）

圖3 C組大鼠的腎臟病理學觀察（HE，×200）

圖4 D組大鼠的腎臟病理學觀察（HE，×200）

圖5 E組大鼠的腎臟病理學觀察（HE，×200）

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者最重要的合并癥之一，也是引起終末期腎臟病的第二位原因[13]。目前，糖尿病腎病的病因以及發病機制仍不明確，但多認為是由各種危險因素與一定遺傳背景共同作用而導致疾病發生[14-16]。一般情況下，血液中的肌酐不會被腎小管重吸收，所以幾乎全部會隨尿液排出體外，據相關研究顯示，腎小球濾過率在早期糖尿病腎病患者中無明顯變化，其體內血肌酐含量不會有顯著變化[17-18]；尿素氮雖能在一定程度上反應腎小球的濾過能力，但容易受到諸如蛋白代謝紊亂、消化道出血等腎外因素影響使得指標發生變化[19]。因此，對血肌酐含量進行檢測能更好地反映早期糖尿病腎病患者的腎臟功能的變化情況。本研究顯示，給藥后，糖尿病腎病大鼠的血肌酐含量雖有略微下降，但差異均無統計學意義（P＞0.05）；此外，糖尿病腎病大鼠在給藥后血清尿素氮含量顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），這表明白皮杉醇可能對糖尿病腎病早期的蛋白代謝紊亂癥狀有一定改善作用。作為腎臟早期損傷的重要標志之一，尿微量蛋白水平能較好地反映出腎小球的損傷情況[20-22]。本次研究顯示，給藥后糖尿病腎病大鼠尿微量蛋白水平顯著下降，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，可以推斷白皮杉醇對腎臟可能有一定的保護作用。