83例苯丙酮尿癥患者pah基因大片段缺失的檢測

張 展，劉 昕，高峻峻，王 萍，朱琳琳，史許鋒，常愛民

(1.鄭州大學第三附屬醫院檢驗科,河南鄭州 450052；2.新鄉醫學院檢驗學院，河南新鄉453000;3.河南省人民醫院婦產科,河南鄭州 450052)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)是新生兒最常見的氨基酸代謝障礙性疾病，是因苯丙氨酸羥化酶基因(phenylalanine hydroxylase gene,pah,612349)突變導致苯丙氨酸羥化酶(pah)活性下降或缺乏，導致血中苯丙氨酸(Phe)濃度增高并在神經系統和血中蓄積[1]，造成嚴重的神經損害，影響患兒發育，甚至危及生命。據統計，我國苯丙酮尿癥發病率約為1∶12 189[2]，而1985-2000年中國主要城市新生兒篩查的PKU發病率為1∶11 307[3]，而近3年河南省PKU的發病率為1∶6 356，高于全國平均水平[4]。本課題組使用MLPA技術聯合Sanger測序,對河南省人群中PKU患者進行pah基因研究，可為PKU患者的診斷以及家系的深入研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年1月在鄭州大學第三附屬醫院科研中心進行基因診斷的高苯丙氨酸血癥的患兒，通過Phe負荷試驗、BH4負荷試驗、尿液蝶呤譜分析確診分型并排除其他代謝性疾病的83例PKU患兒及其父母為研究對象。83例患兒的男女性別比例為41∶42，年齡30 d至10歲。所有受試者檢測均獲得患兒監護人的知情同意，并且符合醫院人體試驗倫理委員會所制定的倫理學標準，得到該委員會批準。

1.2 方法

1.2.1外周血DNA提取 EDTA抗凝全血采用QIAamp?DNA Blood Mini Kit (批號：51106，德國Qiagen公司)按照該試劑盒的DNA提取操作說明書進行外周血樣本的基因組DNA提取，所得樣本基因組DNA經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后保存于-80 ℃超低溫冷藏箱中備用。

1.2.2PCR擴增、基因測序和序列分析比對 在ABI 9700 PCR(美國Applied Biosystems公司)儀上進行聚合酶鏈式反應，采用20 μL的PCR總反應體系，其中2*Master Mix(TIANGEN)10 μL，上下游引物(表1)各0.4 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s(30次循環)，72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產物片段的大小，確定有目的片段并且同引物設計的目的片段大小一致后在ABI 3730測序儀上進行測序，測序結果的峰圖以及序列比對分別采用Chromas Pro 2.1.3和Vector NTI Explorer進行。

1.2.3多重連接探針擴增(MLPA)法檢測pah基因大片段缺失 使用SALSA MLPA probemix P055-D1 pah kit(MRC-Holland公司，荷蘭)對測序無法進行基因分型的PKU患者外周血基因組DNA標本進行pah基因大片段缺失檢測，該試劑盒含有38個探針，其中pah基因所在區域(chromosome 12q23.2)探針22個，上下游探針各1個，參考序列探針14個。MLPA反應參照試劑盒說明書進行，反應產物在ABI3500基因測序儀上進行毛細管電泳，電泳結果采用MLPA專用數據軟件Coffalyser進行分析，拷貝數的判定根據同內參照序列電泳峰面積的比值確定：正常2拷貝比值范圍為0.7～1.3；3拷貝(雜合重復突變)比值范圍為1.4～1.7；單拷貝(雜合缺失突變)比值范圍為0.3～0.6；純合缺失突變的比值范圍為0～0.2。

表1 PCR擴增和測序引物

續表1 PCR擴增和測序引物

2 結 果

2.1 河南省PKU患兒pah基因點突變檢測結果

在對確診的83例PKU患兒中，對其pah基因13個外顯子及其雙側剪接區進行測序分析：在166條染色體中共檢測到62種，162個基因突變，突變檢出率為97.61%。83例患兒中有4例只檢測出1條染色體上等位基因的突變，6例患兒檢測到6個大片段缺失型雜合突變，3例患兒為純合型突變，其余70例患兒均為雜合型突變。

163個突變位點分布于pah基因第2至第12外顯子及第2、3、4、12內含子區域(表2)，發生突變頻率最高的區域是第6、7、11外顯子區域，占總體突變的64.1%；在所有點突變中，發生頻率最高突變類型的為替換突變，其突變頻率為74.4%，其余突變類型依次為剪接區突變、沉默突變、缺失突變和無義突變，突變頻率分別為13.5%、5.8%、3.8%和2.6%；突變頻率最高的位點為c.728G>A(p.R243Q)，突變頻率為15.38%、其次為c.611A>G(p.Y204C)、c.721C>T(p.R241C)、c.1197A>T(p.V399V) 和c.158 G>A(p.R53H)，其突變頻率依次為9.62%、7.05%、7.05%和5.13%，其余位點的突變頻率均在0.64%～4.49%。

表2 河南省83例PKU患兒pah基因突變情況

續表2 河南省83例PKU患兒pah基因突變情況

2.2 河南省PKU患兒pah基因大片段缺失檢測結果

在本研究中，通過MLPA技術共發現6例患者的pah基因出現大片段缺失型突變，缺失突變發生在其pah基因第1、4、5、6、7外顯子及其基因上游的調控區域，其中3例患者(PKU033、PKU039、PKU055)檢測到了發生在pah第4、5外顯子上的大片段缺失(圖1A、B、F)，其血漿Phe濃度分別為0.181、0.196 g/L和0.202 g/L(表3)；2例患者(PKU015、PKU027)檢測到了發生在pah基因第1外顯子的大片段缺失(圖1D、E)，其血漿苯丙氨酸濃度分別為0.072、0.123 g/L(表3)；1例患者(PKU012)檢測到了發生在pah基因第5、6、7外顯子的大片段缺失(圖1C)，其血漿Phe濃度分別為0.329 g/L(表3)。

A：PKU033患者在pah基因第4、5外顯子區域發現大片段缺失；B：PKU039患者在pah基因第4、5外顯子區域發現大片段缺失；C：PKU012患者在pah基因第5、6、7外顯子區域發現大片段缺失；D：PKU015患者在pah基因第1外顯子區域發現大片段缺失；E：PKU027患者在pah基因第1外顯子區域；F：PKU055患者在pah基因第4、5外顯子發現大片段缺失

表3 pah基因大片段缺失型PKU患者一般臨床資料

3 討 論

PKU是常見的遺傳代謝性疾病，其主要機制是人體內pah 基因發生突變，導致pah 結構及活性改變[5]。pah基因突變位點多處于外顯子或者外顯子與內含子的交接區[6]，影響一個或多個氨基酸。根據對pah酶活性有無影響，分為沉默突變和致病突變。沉默突變對pah酶活性無影響。致病突變大部分發生在外顯子或外顯子和內含子的交接區域，嚴重影響 pah基因轉錄和翻譯以及蛋白質異常折疊、聚合，使其加速降解，從而影響 pah 酶的催化活性。pah基因的突變具有位置多變、類型多樣及異質性等特點[7]，而且不同民族和地區之間基因突變的頻率和突變類型存在較大差異[8]。

pah突變的標準分子分析包括對所有的外顯子和外顯子邊緣的Sanger測序，同時可使用多重連接探針擴增技術(MLPA技術)進行補充[9]。pah基因的基因組DNA分析也可以被擴展到EBV -永生化的淋巴細胞提取的cDNA分析，以確定或確認轉錄異常[10]。Sanger測序主要用于檢測錯義突變、剪切位點突變以及小片段的插入和缺失，MLPA技術則可檢測大片段的缺失、復雜的重排及拷貝數變異，二者聯合使用可以取長補短，提高診斷準確率[11]。MLPA是基于分子診斷的敏感有效的技術，包括缺失和大型基因組區域的復制[12]。在PKU患者中，大部分等位基因突變伴隨著錯義突變和大片段缺失。有研究采用MLPA技術，對59例未知突變等位基因的捷克PKU患者進行檢測，發現31例患者攜帶大片段缺失突變[13]。有學者在研究羅馬尼亞人的PKU基因型頻譜時，采用Sanger測序和MLPA、 cDNA分析的結合，達到了對PKU 99%的診斷效率[14]。

本研究中pah基因的突變位點集中在6、7、11、12這4個外顯子及其兩端的內含子剪接區中，同數據庫中的統計結果和以往中國人群中pah基因突變的調查結果基本一致。本研究PCR擴增產物的直接測序結果突變頻率在5%以上的熱點突變中c.728G>A、c.611A>G、c.1197A>T的突變頻率與以往文獻資料相一致[15]，而c.721C>T和c.158G>A的突變發生率較高,其頻率分別為7.05%和5.13%，同其他省份人群的PKU突變熱點不同[1,7,16]，提示其可能是河南人群中pah基因的特有突變。

測序后使用MLPA共檢測到6例PKU患者其pah基因發生大片段缺失突變，6例患者血漿中Phe的濃度相差較大，其中血漿中濃度最低的患者其大片段缺失發生在pah基因的第1外顯子，而發生在第5、6、7外顯子的大片段缺失突變的患者血漿中Phe的濃度最高達0.329 g/L。這種差異存在可能與大片段缺失發生的位置有關，由于pah基因第1外顯子所編碼的氨基酸位于酶蛋白的調控域，而5、6、7外顯子所編碼的氨基酸位于蛋白的活性中心域，因此當區域發生大片段缺失突變時，酶的活性下降程度相對較大。此外，由于大片段缺失突變發生頻率相對較低，對于這種突變的基因型表型的關系研究還需要擴大樣本量進行深入的探討。

綜上所述，使用MLPA進行pah基因大片段缺失的檢測，是對PKU患者常規突變篩查的補充，為PKU患者的診斷治療以及PKU患者家系的研究提供理論依據，值得進一步推廣和應用于臨床診斷。