?鉛鋅尾礦周邊土壤中一株耐鎘貪銅菌的篩選鑒定?

關(guān)鍵詞：耐鎘細(xì)菌;貪銅菌;篩選鑒定;鉛鋅尾礦

中圖分類號：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）12-0008-05

Screening and Identification of a Cd-resistant Cupriavidus Strain from Surrounding Soils of Lead-zinc Tailings

ZHANG Qi-ling，PENG Ling，GUO Feng，DENG Chao，XU Yuan-fang，LI Wen-ge

（Hunan Institute of Nuclear Agricultural Science and Space Mutation Breeding， Hunan Engineering Technology Research Center of Agricultural Biological Irradiation， Hunan Biological Irradiation Technology Engineering Research Center， Changsha 410125， PRC）

Abstract： A cadmium-resistant bacterium strain numbered KYN was isolated by gradient concentration method from soil around lead-zinc tailings. It was identified as Cupriavidus （Cupriavidus sp.） by morphological observation， biochemical characteristics and 16SrDNA sequences and phylogenetic analysis. The microbial cell morphology observations （using electronic microscope） and growth curve determinations indicated that some adaptive morphological changes occurred under 100 mg/L cadmium treatment; the growth of the strain was obviously inhibited under 250 mg/L cadmium treatment; and when the cadmium concentration fell in between 250 mg/L and 700 mg/L， the lag phase of the strain was prolonged， but in the stationary phase its OD value was the same as that under 250 mg/L cadmium treatment. The maximum tolerance concentration of the strain to cadmium is 700 mg/L. The strain was tolerant to Pb2+ and Zn2+， and the growth rate of the strain was obviously inhibited under 500 mg/L plumbum treatment or zinc treatment. With the increase of cadmium concentration， Cd2+ adsorption rate decreased following an increase at first， which was up to 19.106 mg/g under 200 mg/L cadmium treatment. It can be concluded that the strain has high tolerance and good adsorption ability to cadmium， presenting great potential for remediation of Cd-contaminated soil and water.

Key words： Cadmium tolerant bacteria; Cupriavidus sp.; screening and identification; electronic microscope; growth curve

鎘類化合物具有較大脂溶性、生物富集性和毒性。鎘也是土壤中最具運(yùn)動性的重金屬之一[1]。2014年4月，環(huán)境保護(hù)部和國土資源部公布的全國土壤污染狀況調(diào)查結(jié)果顯示，重金屬鎘作為主要的污染物之一，存在于各種土地類型，含量分布呈現(xiàn)從西北到東南、從東北到西南方向逐漸升高趨勢，點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)到7%[2]。鎘離子易被植物根部吸收進(jìn)入食物鏈，被人體吸收后，鎘及其化合物會對人體造成嚴(yán)重危害[3]，鎘還被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)定義為強(qiáng)致癌的物質(zhì)[4]。因此，如何進(jìn)行鎘污染治理，有效去除與鈍化鎘離子成為目前環(huán)境領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。研究表明，微生物能通過對重金屬的胞外絡(luò)合、胞內(nèi)積累、沉淀和氧化還原反應(yīng)等作用，降低土壤中重金屬的生物可利用率，進(jìn)而降低農(nóng)作物和農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的含量[5]，

因此微生物在重金屬污染治理方面具有潛在應(yīng)用價值，目前已成為環(huán)境污染治理的重要研究方向，而篩選新的具有高抗性和吸附能力的微生物并研究它們的抗性和吸附機(jī)理也成為當(dāng)前的主要任務(wù)[6-9]。近年來，分離篩選獲得的耐鎘細(xì)菌包括芽孢桿菌、腸桿菌、分枝桿菌、假單胞菌、氣單胞菌、葡萄球菌、腸球菌和鏈霉菌等[10]，但耐鎘微生物修復(fù)鎘污染的應(yīng)用報道還很少。因此，還需進(jìn)一步挖掘耐鎘微生物資源，以期為微生物修復(fù)鎘污染提供更寶貴的生物資源。本研究從鉛鋅尾礦周邊土壤樣品中分離獲得一株具有耐鎘特性的細(xì)菌菌株，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析判斷為貪銅菌（Cupriavidus sp.），對其耐鎘能力及鎘處理能力進(jìn)行評估，且研究了其對其他重金屬的耐受能力，為該菌的實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2016年11月，在湖南省郴州市桂陽縣黃沙坪鎮(zhèn)上鉛鋅尾礦周邊，采用多點(diǎn)取樣法采集各種淺層土壤，混合后作為耐鎘菌株的分離篩選材料。細(xì)菌的培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15～20 g，加水至1 000 mL，pH值7.2，121℃滅菌30 min，耐鎘細(xì)菌的篩選即在LB培養(yǎng)基中加入CdCl2溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐鎘細(xì)菌的分離 取10 g混合土樣于無菌條件下加入90 mL含有少許玻璃珠的無菌水搖瓶中，37℃ 150 r/min振蕩20 min，取其上清液2 mL加入Cd2+濃度為100 mg/L的LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h，取0.2 mL培養(yǎng)液涂布于Cd2+濃度為100 mg/L的固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于37℃的細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行劃線分離，經(jīng)多次分離純化得到純菌落。

1.2.2 耐鎘細(xì)菌的篩選 分離菌株各取一環(huán)純菌落置于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min 培養(yǎng)24 h。菌懸液按2%的接種量接種于Cd2+濃度為250 mg/L的液體培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min培養(yǎng)48 h，取0.2 mL培養(yǎng)液涂布于Cd2+濃度為250 mg/L的固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于37℃的細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)3次平板培養(yǎng)后，重復(fù)以上步驟依次分別接種于Cd2+濃度更高的液體培養(yǎng)基，觀察生長情況，篩選出耐受能力最強(qiáng)的菌株，斜面保存。

1.2.3 耐鎘菌株的生理生化特性分析 菌株單菌落接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h，參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[11]進(jìn)行革蘭氏染色;參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]及《伯杰氏鑒定手冊》[13]進(jìn)行細(xì)菌常規(guī)的生理生化鑒定試驗(yàn)。

1.2.4 耐鎘菌株的16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 細(xì)菌DNA采用DNA提取試劑盒提取，擴(kuò)增所利用的引物為細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：PCR Mix"25 μL，27F（10 μmol/L）2 μL，1492R（10 μmol/L）2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃ 2 min;98℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s，35個循環(huán);72℃ 5 min終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，采用凝膠回收試劑盒切膠回收后，交由湖南擎科生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源比對分析，利用MEGA軟件構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 耐鎘菌株的電鏡觀察 耐鎘菌株分別接種于含Cd2+濃度為0、100和200 mg/L的LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min培養(yǎng)24 h，5 000 r/min收集菌體細(xì)胞，蒸餾水洗3遍后，經(jīng)過2.5%戊二醛固定、乙醇梯度脫水、冷凍真空干燥等操作后[14]，利用電鏡觀察菌株細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 耐鎘菌株生長曲線的測定 耐鎘菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h，以2%的接種量分別接種于Cd2+濃度為0、250、500、700、800和900 mg/L的200 mL LB肉湯培養(yǎng)基中置于搖床中培養(yǎng)，用紫外可見分光光度計測定不同培養(yǎng)時間下在波長600 nm處的OD值，測定不同Cd2+濃度下耐鎘菌株生長曲線，研究Cd2+濃度對菌株生長特性的影響。

1.2.7 耐鎘菌株對鉛鋅的耐性研究 耐鎘菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h，以2%的接種量分別接種于Pb2+、Zn2+濃度為0、100、500、1 000、1 500、2 000和2 500 mg/L的200 mL LB肉湯培養(yǎng)基中置于搖床中培養(yǎng)，用紫外可見分光光度計測定不同培養(yǎng)時間下在波長600 nm處的吸光值，確定菌株對鉛、鋅的耐性。

1.2.8 耐鎘菌株對鎘去除效果 耐鎘菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃ 150 r/min搖床中培養(yǎng)12 h，以5%的接種量分別接種于Cd2+濃度為50、100、150、200、250和500 mg/L的200 mL LB肉湯培養(yǎng)基中置于搖床中培養(yǎng)24 h，8 000 r /min離心10 min，用ICP測定上清液中的Cd2+濃度，菌體沉淀物干燥后稱重，計算菌株對鎘的去除量，以細(xì)胞干重表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鎘細(xì)菌菌株的形態(tài)特征及生理生化特性

從鉛鋅尾礦周邊土壤中分離到一株耐鎘細(xì)菌菌株，命名為KYN。菌株菌落為規(guī)則圓形，白色，較小，表面濕潤光滑（圖1a），經(jīng)顯微鏡觀察菌株菌體細(xì)胞為桿狀，無莢膜，無鞭毛，革蘭氏染色陰性（圖1b）。該菌株不能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇，能發(fā)酵木糖產(chǎn)酸，水解淀粉，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陽性，V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、精氨酸脫羧基酶試驗(yàn)和賴氨酸脫羧基酶試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性。

2.2 菌株的16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增出來的產(chǎn)物大小約為1 500 bp，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。菌株的測序序列通過Blast同源比對分析，結(jié)果表明其與Cupriavidus"oxalaticus、Cupriavidus taiwanensis和Cupriavidus nantongensis等菌種的典型菌株同源性達(dá)98%～99%，利用MEGA軟件構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），表明菌株KYN與Cupriavidus屬的細(xì)菌菌株親緣關(guān)系最近。綜合菌株生理生化特性分析、16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，表明分離到的耐鎘菌株KYN為貪銅菌。

2.3 耐鎘菌株的電鏡觀察

用電鏡觀察在含Cd2+濃度為0、100和200 mg/L的LB肉湯培養(yǎng)基中生長的菌體細(xì)胞胞外形態(tài)，由圖4可以看出，不同Cd2+濃度下菌體形態(tài)發(fā)生了適應(yīng)性變化，無Cd2+條件下菌體長桿狀，表面光滑;Cd2+濃度為100 mg/L條件下生長的菌體呈短桿狀，菌體變粗，菌體間雜質(zhì)增多，菌體表面有較大顆粒附著;Cd2+濃度為200 mg/L條件下生長的菌體則進(jìn)一步變短變粗，雜質(zhì)也更多。顆粒附著可能是隨著Cd2+濃度的增加，鎘對菌體產(chǎn)生毒害作用，菌體通過表面吸附的作用沉淀金屬離子，從而降低Cd2+毒性，增加菌體的生存能力[15];而菌體形態(tài)改變可能與在形態(tài)學(xué)發(fā)生過程中的重金屬離子所起的作用有關(guān)系[16-17]，但是存在生存機(jī)制還是菌體遭受毒害表現(xiàn)目前并不清楚[9]。

2.4 不同Cd2+濃度對耐鎘菌株生長特性的影響

圖5是菌株KYN在不同Cd2+濃度下的生長曲線。結(jié)果表明：在Cd2+濃度為250 mg/L條件下，菌株遲緩期延長且穩(wěn)定期的OD值明顯降低，說明菌株生長受到明顯抑制;當(dāng)Cd2+濃度為500和700 mg/L條件下，菌株遲緩期從8 h延長到24和60 h，但穩(wěn)定期OD值與Cd2+濃度為250 mg/L時差不多;說明菌株一直在對Cd2+濃度進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，且250 mg/L

2.5 耐鎘菌株對鉛鋅的耐性研究

圖6是不同濃度條件下Pb2+和Zn2+對菌株KYN生長的影響。由圖6可知，在離子濃度為100 mg/L時，菌株生長量較未經(jīng)Pb2+和Zn2+處理?xiàng)l件下生長量有所增加，說明Pb2+、Zn2+對菌株的生長有一定的促進(jìn)作用;在Pb2+和Zn2+濃度為300 mg/L條件下，菌株生長穩(wěn)定期的OD值明顯降低，說明菌株生長受到明顯抑制;在Pb2+和Zn2+濃度為500 mg/L條件下，菌

株遲緩期延長到36 h，說明菌株在500 mg/L濃度條件下還能進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)整，但生長進(jìn)一步受到抑制。總體來說，菌株KYN對Pb2+和Zn2+耐性較強(qiáng)，對Pb2+和Zn2+最高耐受濃度均為500 mg/L。

2.6 耐鎘菌株對鎘去除效果

圖7是菌株KYN在不同Cd2+濃度條件下（50～500 mg/L）的鎘去除量。隨著Cd2+濃度的增加，鎘去除量表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢;其中，在Cd2+濃度為200 mg/L時達(dá)到最大值，為19.106 mg/g;當(dāng)Cd2+濃度>200 mg/L時，鎘去除量開始下降，說明細(xì)胞生長受到影響，生長量減少，從而影響菌株對鎘的去除效果。

3 結(jié)論與討論

通過采集湖南某鉛鋅尾礦周邊土壤，濃度梯度篩選得到1株耐鎘菌株，菌株編號為KYN。經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析判斷為貪銅菌。貪銅菌屬中一些菌種如Cupriavidus metallidurans，Cupriavidus necator和Cupriavidus taiwanensis等已報道為一些重金屬耐性菌株，但耐鎘菌株目前報道較少。對菌株進(jìn)行電鏡形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著Cd2+濃度的增加，菌體形態(tài)發(fā)生改變，菌體間雜質(zhì)增多，菌體上顆粒附著增多，可能是菌體通過表面吸附的作用沉淀重金屬離子，重金屬離子又引起菌株形態(tài)學(xué)變化，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。菌株生長曲線測定結(jié)果表明，在Cd2+濃度為250 mg/L條件下，菌株生長受到明顯抑制，但在250 mg/L

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉愛民. 耐鎘細(xì)菌篩選與吸附鎘機(jī)理研究及其在鎘污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[2] 環(huán)境保護(hù)部，國土資源部. 全國土壤污染狀況調(diào)查公報[EB/OL]. http：//www.zhb.gov.cn/gkml/hbb/qt/201404/t20140417_270670.htm，2014-04-17.

[3] Alkorta I，Hernández A J，Becerril J M，et al. Recent findings on the phytoremediation of soils contaminated with environmentally toxic heavy metals and metalloids such as zinc， cadmium， lead， and arsenic[J]. Reviews in Environmental Science and BioTechnology，2004（3）：71-90.

[4] Hossain Z，Huq F. Studies on the interaction between Cd2+ ions and nucleobases and nucleotides[J]. Journal of Inorganic Biochemistry，2002，90（3）：97-105.

[5] 馬占強(qiáng). 苜蓿中華根瘤菌CCNWSX0020抗銅基因的克隆與功能驗(yàn)證[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

[6] 應(yīng)嬌妍，袁紅莉，李寶珍. 一株莖點(diǎn)霉菌的抗鎘機(jī)制[J]. 中國環(huán)境科學(xué)，2003，23（6）：575-578.

[7] 潘建華，劉瑞霞. 蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus吸附鉛的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)，2004，25（2）：166-169.

[8] 呼 慶，齊鴻雁，竇敏娜，等. 強(qiáng)抗鎘蠟狀芽孢桿菌的分離鑒定及其抗性機(jī)理[J]. 環(huán)境科學(xué)，2007，28（2）：427-430.

[9] 劉紅娟，張 慧，黨 志，等. 一株耐鎘細(xì)菌的分離及其富集Cd的機(jī)理[J]. 環(huán)境工程學(xué)報，2009，3（2）：367-371.

[10] 周 賡，楊 輝，潘 虎，等. 一株耐鎘鏈霉菌的篩選、鑒定與基本特性分析[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2017，37（6）：2076-2084.

[11] 吳 坤，張世敏. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：氣象出版社，2004.

[12] 東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[13] R E 布坎南，E N 吉本斯，著. 中國科學(xué)院微生物研究所譯. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊（第八版）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1984.

[14] 謝家儀，董光軍，劉振英，等. 掃描電鏡的微生物樣品制備方法[J]. 電子顯微學(xué)報，2005，24（4）：440.

[15] 付 瑾，謝學(xué)輝，錢 林，等. 皮氏羅爾斯通氏菌株DX-T3-01的耐鎘性能及鎘富集機(jī)理[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2011，17（5）：717-721.

[16] Tucker S L，Thornton C R，Tasker K，et al. A fungal metallothionein is required for pathogenicity of Magnaporthe grisea[J]. Plant Cell，2004（16）：1575-1588.

[17] Wu C M，Lin L Y. Immobilization of metallothionein as a sensitive biosensor chip for the detection of metal ions by surface plasmon resonance[J]. Biosensors and Bioelectronics，2004，20（4）：864-871.

[18] 郭照輝，單世平，張德元，等. 1株高耐鎘菌株的分離與鑒定及16S rDNA序列分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，40（2）：207-210.