?基于淀粉合成基因TRAP標記的甘薯種質資源遺傳多樣性分析?

摘 要：為探究淀粉合成相關基因在甘薯種質資源中的遺傳多樣性，通過對錨定引物的篩選構建了基于淀粉合成基因的TRAP分子標記技術，并對59份不同作用類型的甘薯種質資源進行遺傳多樣性分析。TRAP分子標記篩選結果表明：SAI/me2、AGPase/em4和β-Amylase/me2這3對引物組合在分子標記中存在較為豐富的多態性片段，結果重復性好，可作為TRAP分子標記;其中，AGPase/em4分子標記的區分能力最強，能將59份甘薯資源進行較好的區分。甘薯種質資源遺傳多樣性分析結果表明：不同類型的甘薯種質資源之間無明顯的遺傳群體區分。研究表明，甘薯基因組為六倍體起源，其淀粉合成相關基因存在多基因遺傳作用，在不同甘薯種質資源之間存在一定的遺傳差異，因而可以開發成有效的分子標記。

關鍵詞：甘薯;淀粉合成基因;遺傳多樣性;TRAP分子標記;聚類分析

中圖分類號：S188 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）12-0013-05

Genetic Diversity Analysis of Sweet Potato Germplasm Resources Based on TRAP Markers of Starch Synthesis Gene

ZHANG Dao-wei1，YIN Qin1，2，DONG Fang1，HUANG Yan-lan1，ZHOU Hong1，

ZHANG Ya1，ZHANG Chao-fan1

（1. Hunan Crop Research Institute， Changsha 410125， PRC; 2. College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University ， Changsha 410128， PRC）

Abstract： To explore the genetic diversity of starch synthesis genes in sweet potato， the TRAP molecular marker based on starch synthesis genes was constructed by screening anchored primers， and genetic diversity of 59 different types of sweet potato germplasm resources was analyzed. The results show that for the 3 pairs of primer combinations SAI/me2， AGPase/em4 and beta-Amylase/me2， the polymorphic fragments are abundant and stable， and thus can be used as ideal TRAP molecular markers. Among them， AGPase/em4 molecular markers has the highest discrimination and reliability， which can distinguish 59 sweet potato resources in this test. No obvious genetic population differentiation among different types of sweet potato germplasm resources was found by the genetic diversity analysis.Previous studies have shown that the genome of sweet potato is the origin of hexaploid， and its starch synthesis genes suggests polygenic inheritance and indicates genetic diversity among different sweet potato germplasm resources. Thus the starch synthesis genes can be developed as effective molecular markers.

Key words： sweet potato; starch synthesis genes; genetic diversity; molecular markers; TRAP molecular markers; cluster analysis

淀粉（Starch）是一種多糖，是作物光合產物的主要儲存形式。甘薯中的淀粉除了食用和食品加工用外，也廣泛應用于發酵、飼料、醫藥、化工、造紙、紡織、鑄造、皮革等行業[1]，是重要的糧食和工業原料。淀粉含量是構成甘薯產量的主要因素，其形成與積累方式決定了品種的產量和干率[2]。我國不同類型的甘薯種質資源中薯塊淀粉含量差異較大，且遺傳多樣性較為豐富，雜交子代性狀分離明顯。因此，淀粉含量是甘薯育種和栽培研究的重要考核指標。我國已培育了徐薯22、商薯19等一大批高淀粉型甘薯新品種，這些品種具有產量高、淀粉含量高、干物質轉化快、凈同化率高等特點[3-4]。

淀粉在植物體中存在2種合成途徑：一種是ADP葡萄糖（ADPG）途徑，另一種為淀粉磷酸化酶催化途徑。2種途徑均受多基因的復雜調控，需要ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-Glucose Pyrophosphorylase，AGPase）、顆粒結合淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SSS）、淀粉分支酶（SBE）以及淀粉脫分支酶（DBE）的共同參與[5]。此外，蔗糖合成酶（Sucrose Synthase）基因SuSy、可溶性酸性轉化酶（Soluble Acid Invertase）基因SAI、蔗糖磷酸合成酶（Sucrose Phosphate"Synthase）基因SPS、淀粉合酶（Starch Synthase）基因StSy、β-淀粉酶（β-Amylase）基因等也在淀粉合成途徑中有至關重要的作用[6-9]。由于甘薯具有復雜的多倍體基因組，同源基因之間存在豐富的拷貝，比較這些關鍵酶基因的遺傳差異可以解析甘薯種質資源遺傳多樣性產生的原因。

靶位區域擴增多態性（Target Region Amplified Polymorphism，TRAP）是在相關序列擴增多態性（Sequence-related Amplified Polymorphism，SRAP）基礎上進一步優化改良而來[10]，通過已知的生物序列信息，利用生物信息學工具和表達序列標簽（Expressed sequence tags，EST）數據庫的信息設計錨定引物和隨機引物，對目標候選基因序列區進行PCR擴增得到多態性結果的標記，能更好地體現目標基因區多態性表型的差異，更適于遺傳多樣性研究[11-12]。該技術最先在向日葵中開發應用，目前已成功應用于水稻、菜豆、大麥、小麥、甜菜等作物[13]。隨著甘薯大量轉錄組數據的公布，甘薯TRAP標記具有更明顯的優勢，因而對甘薯種質資源淀粉合成基因進行遺傳多樣性分析，并建立基于淀粉合成基因的TRAP標記技術，對優質專用型甘薯新品種的選育和栽培具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從湖南省作物研究所甘薯種質資源圃中選擇59份具有代表性的資源，分為淀粉型、紫薯、鮮食、莖葉菜用、觀賞和藥用等類型，如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 TRAP引物設計方法 參照TRAP分子標記引物設計原則[14]，錨定引物設計如下：（1）根據甘薯轉錄組數據獲得候選基因序列，將序列在NCBI進行blast驗證;（2）利用Primer5設計6對靶標引物（表2），結合位點多位于開放讀碼框上游，隨機引物使用Li等[11]報道的15條隨機引物（表3），靶標引物和隨機引物之間隨機組合。

1.2.2 甘薯葉片總DNA提取 采用改良后的CTAB提取法提取甘薯葉片基因組總DNA[15]。

1.2.3 最適分子引物的篩選及反應體系 隨機取多份樣品DNA混合物為模板，根據靶標引物和隨機引物的90對組合，進行最適引物篩選，記錄PCR產物各引物組合電泳條帶數，篩選條帶較多且明亮清晰的組合為TRAP分子標記引物組合。PCR反應條件為：94℃ 3 min;94℃ 45 s，35℃ 45 s，72℃ 3 min，2個循環;94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 3 min，38個循環;72℃ 10 min;16℃ 1 h。

1.2.4 TRAP分子標記遺傳多態性統計與賦值 采用篩選的引物組對所有的試驗樣品進行TRAP標記分析檢測，PCR結果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。電泳結果用Cambirdge的UVITEC系列凝膠成像系統自帶軟件進行自動識別，以DNA mark和多數樣品共有的序列為參照，根據實際條帶分布進行多態性分析及結果記錄。同一個多態性位點有條帶記為1，無條帶記為0，特殊條帶單獨賦值為一個多態性位點。分子標記檢測至少需要2次生物學重復結果，各重復之間多態性結果穩定一致才采納為統計數據。

1.2.5 TRAP分子標記聚類分析和主成分分析 采用NTsys-pc 2.10e 軟件生成相似系數矩陣或關聯度值，并采用非加權類平均法，進行SAHN聚類分析，構建甘薯淀粉不同基因的聚類圖。使用NTsys-pc 2.10e軟件中的Dcenter模塊對GS矩陣做中心化處理，獲得主成分分析圖。

2 結果與分析

2.1 淀粉合成基因相關分子標記分析

以多種甘薯資源的混合DNA為模板對90對引物組合進行篩選，電泳條帶數量表示該引物組在甘薯基因組可能的結合位點數量，間接反應了該基因在甘薯基因組的核苷酸片段多態性。由表4可知，甘薯淀粉合成相關基因的核苷酸片段多態性較為豐富，以SAI/em2、SAI/em4、SAI/em6、SAI/me2、SAI/AN2、SPS/em1、AGPase/em3、AGPase/em4、AGPase/AN4、β-Amylase/em1、β-Amylase/me2這些引物組合獲得的核苷酸多態性片段數較多，可作為候選TRAP分子標記。

2.2 分子標記指紋圖譜質量的比較與篩選

對候選TRAP分子標記進行不同種質資源間的重復性和多態性驗證，結果顯示，SAI/me2（圖1a）、AGPase/em4（圖1b）、β-Amylase/me2（圖1c）這3對引物組合在分子標記中存在較為豐富的多態性片段，結果重復性好，可作為TRAP分子標記。

2.3 甘薯種質資源淀粉合成基因遺傳多樣性聚類分析

分別以篩選的TRAP分子標記對種質資源進行多態性分析，根據多態性統計數據，建立甘薯種質資源的聚類樹狀圖（圖2），其中AGPase/em4（圖2b）分子標記的區分能力最強，基本能將59份甘薯資源進行較好的區分;而分子標記SAI/me2 （圖2a）、β-Amylase/me2（圖2c）在諸多種質資源中存在相同的指紋圖譜，因而不能將59份甘薯種質資源有效區分開來。

2.4 甘薯種質資源群體遺傳的多樣性分析

將3個分子標記的統計數據進行整合，匯編成一個完整的指紋圖譜，并根據指紋圖譜進行各種質資源的主成分分析，結果如圖3所示。各資源分布的位置代表了其遺傳關系，2份資源所處的點越接近，表明其遺傳距離越小;而分布較為密集的區域視為一個遺傳群體。從圖3可看出，不同類型的甘薯種質資源之間無明顯的遺傳群體區分。

3 結論與討論

近年來，甘薯淀粉合成相關基因的多態性研究成為國內外關注的重點。甘薯種質資源中淀粉合成酶、淀粉分支酶和去分支酶等基因均存在豐富的單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）和插入缺失標記多態性（insertion-deletion，inDel）。李豐[16]通過對甘薯淀粉合成相關基因的克隆和SNP分子標記，初步認為SNP多態性和inDel多態性與淀粉含量有關。這些多態性和遺傳多樣性都是生物多樣性產生的主要遺傳基礎。因此利用分子標記方法對淀粉合成相關基因的遺傳多樣性分析能進一步解析甘薯淀粉遺傳機理。而TRAP分子標記因為其效率高、準確性好、穩定性高的特點在品種鑒定、遺傳多樣性分析、系譜分析、遺傳圖譜構建、突變體檢測、基因定位[17]、分子標記輔助選擇等領域應用廣泛。該研究篩選出SAI/me2、AGPase/em4和β-Amylase/me2這3對基于甘薯淀粉合成相關基因的TRAP分子標記，其中AGPase/em4分子標記的區分能力最強，基本能將59份甘薯資源進行較好的區分;應用這3對TRAP分子標記對59份不同作用類型的甘薯種質資源進行遺傳多樣性分析，結果表明，不同類型的甘薯種質資源之間無明顯的遺傳群體區分。甘薯基因組為六倍體起源，其淀粉合成相關基因可能存在多基因遺傳作用，因此不同甘薯種質資源存在一定的遺傳差異。這為后續優質專用型甘薯新品種選育和種質資源評價利用提供了參考。

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