?柑橘采后主要病原菌的生物學特性研究?

摘 要：研究不同環境因子下柑橘綠霉病（指狀青霉）、青霉病（意大利青霉）病原菌的生長生物學特性。分析不同的培養基、不同碳源、不同氮源、不同溫度、不同pH值、不同鹽度對指狀青霉、意大利青霉生長所產生的影響。結果表明：采用PDA、SDA、PSA、YPGA等培養基培養2種青霉時，菌生長直徑較大（>40 mm）、菌絲生長濃密、生長速度快;替換CA培養基中的蔗糖，當碳源采用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉時，菌生長效果較好，菌落直徑大于20 mm，菌絲密集度表現濃密或較濃密;酵母粉、蛋白胨、甘氨酸等有機氮對2種青霉病原菌菌絲的生長具有良好的促進作用。2種菌株在4～35℃范圍內均可生長，最適生長溫度為28～30℃;菌株能生長的pH值為2～12，最適生長的pH值為5～7;高濃度（4%以上）的鹽水可以殺滅2種青霉菌;75℃是青霉菌的致死溫度。

關鍵詞：柑橘;采后;主要病原菌;生物學特性

中圖分類號：S436.66 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）12-0076-06

Study on Biological Characteristics of Main Pathogens in Postharvest Citrus

DING Ren-hui1，HE Xiao-e1，WANG Wen-long1，HUANG Wei-weng1，SHI Hao1， 2

（1. College of Agriculture and Forestry， Hunan Applied Technology University， Changde 415100， PRC; 2. College of Horticulture and Landscape， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC）

Abstract： To study the growth and biological characteristics of pathogens Penicillium digitatum and Penicillium italicum under different environmental factors， the effects of different culture medium， carbon source， nitrogen source， temperature， pH value and salinity on the 2 pathogens were detected. The results show that： cultivated in PDA， SDA， PSA and YPGA medium， the diameters of the 2 strains of Penicillium fungi are both larger （gt;40 mm）， the mycelia are dense and grow faster. Replacing sucrose in CA medium with glucose， maltose， lactose and soluble starch as carbon sources， the growth effect of the fungi is better， with the diameters of the fungal colonies exceeding 20 mm， and the mycelia dense or moderately dense. Organic nitrogen such as yeast powder， peptone and glycine can promote the mycelia growth of the 2 Penicillium strains. The 2 strains can grow within the temperature range from 4℃ to 35℃ and the pH value of 2 to12， while they grow best at 28℃ to 30℃ and pH 5 to 7. Salt brine of high concentration （gt; 4%） can kill the 2 strains of Penicillium and 75℃ is the lethal temperature for them.

Key words： Citrus; postharvest; main pathogens; biological characteristics

柑橘屬于蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）植物，是世界范圍內第一大宗水果，也是我國南方各省普遍生產的重要果品。2017年，湖南省柑橘種植面積38萬hm2，產量517萬t[1-2]。我國柑橘以鮮銷為主，南方地區高溫多濕，柑橘果實采后容易腐爛，嚴重影響其經濟效益，這一問題受到廣大研究者和果農的極大關注，果實采后病害問題也日益受到重視[3-5]。新鮮柑橘產品品質的惡化受諸多因素的影響，如柑橘組織的生理失調或衰老、病原微生物侵染、采收及采后環節中的機械損傷等，但真菌病害侵染是最主要的原因。柑橘貯藏期的真菌性病害大多數是由弱性寄生的真菌引起的，如指狀青霉（P. digitatum）和意大利青霉（P. italicum）。這些病原菌侵入果實都需要通過果皮上的各種傷口、果蒂切口及蒂緣組織等[6-7]。傷口是感染的必要條件，果皮的有色層含有油脂具有抗性，傷及白皮層則易引起感染，因此，果實在采收、包裝、運輸和貯藏過程中，如果受傷，就會增加發病機會。相關研究表明，由真菌引起的采后病害主要有青霉病（italicum）、酸腐病（Oospora citri-aurantii）、黑色蒂腐病（DiPtodia nalalensis Evan）、褐色蒂腐病（Phompsis citri （Fawcett） Wolf）、黑斑病（Guignardia citricarpa Kiely）和炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides Penz）等[8-10]。而以青霉等引起的腐爛最為嚴重，占總發病率的80%以上，青霉病菌主要危害果實，果實染病后多在近成熟期和貯藏期發病[11]。適宜條件下，從開始發病到全果腐爛只需要7～14 d，腐爛部分可深入到果心。病原菌P. italicum產生青藍色粉狀物，白色霉狀物很窄，僅1～3 mm，腐爛的速度較慢，在20℃左右全果腐爛要15 d;P. digitatum產生的粉狀物藍綠色，白色霉狀物帶較寬，約8～15 mm，腐爛速度較快，在20℃左右全果腐爛約要7 d[8]。柑橘實際貯藏過程中，果實及病原菌所處環境在一定范圍內是變動的，在具體條件下，病原菌的生長特性對推斷病害的發生速度，病害嚴重程度及制定防治措施、防治時間等有重要意義。研究通過設置不同的外部條件，培養病原菌，定量研究外部環境因子對菌絲生長的影響，以及菌培養條件下病斑擴展的情況，更符合實際的侵染和病害發展。針對柑橘采后主要病害青霉病，研究青霉生長生物學特性，以期為青霉的快速培養、擴繁，以及找出柑橘安全貯藏和影響病害發生發展的關鍵因子，為柑橘采后病害的無污染防除技術和保鮮技術提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

供試菌種為意大利青霉（Penicillium italicum）、指狀青霉（Penicillium digitatum），均由實驗室自行分離鑒定所得。無菌水、乙醇、PDA培養基、馬鈴薯蔗糖培養基（PSA）、清水瓊脂培養基（WA）、沙氏培養基（SDA）、燕麥培養基（OA）、玉米粉培養基（CMM）、查氏培養基（CA）、高氏1號培養基、LB培養基、酵母蛋白胨葡萄糖瓊脂培養基（YPGA）、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、木糖、乳糖、D-山梨醇、可溶性淀粉、肌醇、D-半乳糖、硝酸銨、蛋白胨、硝酸鉀、尿素、L-丙氨酸、草氨酸、L-賴氨酸、氯化銨、甘氨酸、酵母粉、硫酸銨等，中國醫藥集團上海化學試劑公司，試劑為分析純。

1.2 主要實驗儀器

LRH-150S恒溫培養箱（金壇市國旺試驗儀器廠產品）;BCD-210R冰箱（合肥榮事達三洋電器股份有限公司）;BA3100igital電子顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）;OK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）;TG16-WS離心機（江蘇金壇市金城國旺試驗儀器廠）;SW-CJ-2D超凈臺（蘇州自動化儀器儀表研究所 蘇州華科凈化設備有限公司）;JA2003N電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）;YXQ-SL-100S11 高壓滅菌鍋（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同培養基對病原菌的影響 設置10個處理，分別是PDA培養基、清水瓊脂培養基（WA）、沙氏培養基（SDA）、馬鈴薯蔗糖培養基（PSA）、燕麥培養基（OA）、察氏培養基（CA）、高氏1號培養基、LB培養基、玉米粉培養基（CMM）、酵母蛋白胨葡萄糖瓊脂培養基（YPGA）。將培養3 d的菌餅（直徑d=6 mm）分別接種至不同的培養基平板中央，每一個處理重復3次，放于恒溫25℃進行3 d的暗培養后，采用十字交叉法來測量病原菌的菌落直徑，并記錄菌絲密集度。

1.3.2 不同碳源對病原菌的影響 設置10個處理，分別以可溶性淀粉、肌醇、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖、木糖、D-半乳糖、D-山梨糖9種碳源代替CA培養基中的蔗糖，以無碳的處理作為對照（CK）。將培養3 d的菌餅（d =6 mm）分別接種至不同的培養基平板中央，每一個碳源處理重復3次，放于恒溫25℃進行3 d的暗培養后，采用十字交叉法來測量病原菌的菌落直徑，并記錄菌絲密集度。

1.3.3 不同氮源對病原菌的影響 設置10個處理，分別以酵母粉、蛋白胨 、甘氨酸、氯化銨、L-賴氨酸、硝酸鉀、硝酸銨、L-丙氨酸、尿素9種氮源代替CA培養基中的硝酸鈉，以無氮的處理作為對照（CK）。將培養3 d的菌餅（d=6 mm）分別接種至不同的培養基平板中央，每一個氮源處理重復3次，放于恒溫25℃進行3 d的暗培養后，采用十字交叉法來測量病原菌的菌落直徑，并記錄菌絲密集度。

1.3.4 不同溫度對病原菌的影響 設置10個溫度處理，分別為3、5、10、15、20、25、28、30、32、35℃。將培養3 d的菌餅（d=6 mm）接種到PDA平板的中間位置，每一個處理重復3次，放在不同的恒溫培養箱中進行3 d的暗培養后，采用十字交叉法來測量菌落直徑，并記錄菌絲密集度。

1.3.5 不同p H對病原菌的影響 設置10個pH值處理，分別把培養基的pH值調整至2.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0。將培養3 d 的菌餅（d=6 mm）接種至不同pH值的PDA平板中央，每一個處理重復3次，在恒溫25℃的條件下進行3 d的暗培養后，采用十字交叉法來測量菌落直徑，并記錄菌絲密集度。

1.3.6 不同鹽度對病原菌的影響 設置8個鹽度處理，分別為0%、0.1%、0.3%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%。以滅菌的25%氯化鈉溶液來調節無菌水至設定鹽度，將培養3 d的菌餅（d=6 mm）接種到不同鹽度的PDA平板中央，每一個處理重復3次，放入恒溫培養箱中進行3 d的暗培養后，采用十字交叉法來測量菌落直徑，并記錄菌絲密集度。

1.3.7 病原菌致死溫度的測定 將菌餅（d=6 mm） 置于裝有5 ml無菌水的離心管中，將離心管分別置于50～80℃（溫度梯度為5℃） 的恒溫水浴鍋中處理15 min，迅速冷卻后，接種至新鮮的PDA培養基上，以未經過處理的菌絲塊為對照。試驗重復3次，放在恒溫25℃條件下暗培養，每天進行觀察。有菌絲生長的記作“+ ”，沒有菌絲生長的記作“-”。

1.3.8 數據分析及圖形制作 采用WPS軟件進行數據處理及圖表的制作。采用Statistix 8.0軟件對試驗數據進行統計分析。表中不同小寫字母表示α=0.05極顯著性水平，Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對病原菌絲生長的影響

不同培養基對柑橘采后主要病原菌絲的生長具有較大的差異性，如表1所示，采用PDA、SDA、PSA、YPGA等培養基培養2種真菌時，菌生長直徑較大（>40 mm）、菌絲生長濃密、生長速度快，說明這些培養基都較適合這2種菌的生長。同時菌在CA、高氏1號、OA、CMM等培養基中生長時效果要明顯低于前面的幾種培養基，菌生長直徑在15～30 mm，菌雖能生長，但生長狀態較差，菌絲密集度較濃密或稀疏。菌在WA、LB培養基中幾乎不能生長，完全不能作為2種真菌的培養基。因此，在選擇這2種柑橘病害的真菌進行培養、擴繁時，盡量考慮前4種培養基。

2.2 不同碳源對病原菌菌絲生長的影響

不同碳源對病原菌生長具有較大的影響，試驗結果如表2所示，當碳源采用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉時，2種菌生長效果較好，菌落直徑大于20 mm，菌絲密集度表現濃密或較濃密，可以看出一般含有葡萄糖或者含有葡萄糖的二糖、多糖的碳培養基較適合這2種菌的生長，而含有肌醇、甘露醇、乳糖、木糖、D-半乳糖、D-山梨糖等單糖的培養基不適宜二者的生長，菌絲直徑一般都小于15 mm，菌絲密集度一般都是稀疏或者幾乎不生長，說明這2種菌對碳源——糖的利用具有較大的選擇性。

2.3 不同氮源對病原菌菌絲生長的影響

不同氮源對病原菌絲生長的影響不是很大，由表3可知，各不同氮源處理培養基對2種真菌的培養，其真菌生長狀況大致相同，菌絲生長直徑幾乎都在30 mm以上，就連對照CK試劑空白組菌絲生長直徑也在30 mm以上，這說明2種真菌生長不需要再添加額外的氮源。同時添加酵母粉、蛋白胨、甘氨酸等有機氮的培養基相對于無機氮來說，更利于這2種真菌的生長，可能是因為真菌對有機氮有部分的利用。因此，在培養這2種真菌時可添加少量的有機氮，從而更有利于菌的生長、擴繁。

2.4 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響

溫度對病原菌的生長具有較大的影響，由表4可知，當菌生長溫度低于3℃的時候，菌絲幾乎不生長，指狀青霉有略微的生長（3.2 mm），隨著溫度升高，菌生長速度加快，生長量增加，當生長溫度達到20℃時，2種菌的生長直徑分別達到了28.0 mm和31.0 mm。由此可知，低溫保存可以抑制或減緩柑橘的發病。當菌培養溫度在28～30℃時，菌生長狀況最佳，菌絲生長直徑達到了50 mm及以上，菌絲生長速率快，生長非常濃密，這也是最容易發生柑橘病害的溫度。當培養溫度的繼續上升，菌絲生長有略微的放緩。

2.5 不同pH值對病原菌菌絲生長的影響

pH值對菌生長同樣具有較大影響，由表5可知，當培養基pH值處于2.0時，2種菌生長直徑僅僅為2～3 mm，說明當pH過低時不利于菌的生長。當pH值達到5.0時，菌生長速度明顯加快，此時菌絲生長直徑達到了30 mm以上，說明這2種真菌能夠在較弱酸性條件下生長。菌在pH值6～7時生長狀況最佳，菌絲直徑達到了45 mm以上、菌絲濃密，說明菌非常適合在弱酸或中性條件下生長。隨著pH值的繼續升高，菌生長逐漸放緩，當pH值達到13.0時，菌生長已幾乎完全得到了抑制。因此，果子貯藏時盡量不要貯藏在酸性或弱酸性條件下。

2.6 不同鹽度對病原菌菌絲生長的影響

不同鹽度對病原菌的生長具有較大的差異，由表6可知，當鹽度的濃度在1.0%以下時，菌生長幾乎沒有影響，且低濃度的鹽有利于菌絲的生長，例如當鹽濃度為0時，菌絲生長直徑為50 mm左右，鹽濃度為0.3%時，菌絲生長直徑達到了57 mm。隨著培養基鹽濃度的提高，對菌絲的生長表現出了抑制的現象，當鹽濃度達到4%時，意大利青霉生長已被完全抑制，指狀青霉生長也幾乎得到完全抑制，生長直徑僅為4.4 mm，高濃度的鹽可抑制或殺滅真菌的生長，這可能與真菌細胞的滲透壓有關，導致細胞破壞而死亡。

2.7 病原菌致死溫度的測定

病原菌致死溫度的試驗結果如表7所示，當病原菌處理溫度在50℃時，菌絲生長已得到了較強的抑制，僅為20 mm左右。隨著處理溫度的逐步提高，菌絲生長直徑越來越小，菌絲越來越稀疏，菌生長被抑制得越發嚴重。當處理溫度達到75℃時，菌生長幾乎完全被抑制，過高的培養溫度可能影響細胞的生理代謝，細胞功能混亂，最終導致細胞破壞、死亡。因此，可采用75℃以上的溫度處理殺滅這2種真菌。

3 小結與討論

PDA、SDA、PSA等含有葡萄糖、蔗糖、土豆、瓊脂、有機氮等培養基有利于青霉的生長。碳源是構成微生物細胞或者代謝產物中碳素來源的營養物質，在對比不同碳源的測定實驗中，含有葡萄糖的單糖或相應二糖、多糖對病原菌菌株的生長具有明顯的促進效果，原因可能是病原菌對葡萄糖的利用率高[12]。氮源是作為構成生物體的蛋白質、核酸及其他氮素化合物材料，微生物的生長和產物的合成都需要氮源。通過對不同的氮源進行測定，對病原菌菌株生長明顯有促進效果的是酵母粉，原因可能是氮源中的有機氮比無機氮的吸收效率好[8]。溫度及pH值是病原菌生長中重要的環境影響因子，同時也是病原菌生長的重要理化因子，試驗發現病原菌株在3～35℃都可以生長，但是最適合生長的溫度為28℃左右;在pH值為2～12時也都可以生長，但是最適合生長的pH值為5～7;這一結果與劉瑜、陶能國、韓建榮[13-15]等的試驗結果稍有不同，差異可能是病原菌菌株種屬不同或者是生長環境不同所導致的。經不同溫度處理后發現病原菌在75℃及以上未見菌絲生長，說明病原菌的致死溫度為75℃。由于柑橘采后病原菌具有很強的環境適應生存能力，在柑橘儲藏的一般溫度和pH范圍內依舊能夠生存及產生孢子，使柑橘患病。因此，在柑橘采摘、運輸過程中要避免發生機械損傷，并進行低溫貯藏或者采用相應保鮮防腐劑處理等方法，才能有效防止柑橘綠霉病、青霉病的發生[16]。

病原菌對鹽具有一定敏感性，當鹽度超過1.0%時，可抑制真菌，超過4.0%時可殺滅病原菌，可能是因為高濃度的鹽水可使病原菌菌絲的滲透壓失調，造成短時間內菌體嚴重脫水，從而達到殺滅菌的目的。試驗研究了7個因素對青霉的生長的影響，后期可進一步深入研究光照輻射、釋放惰性氣體、釋放拮抗菌等，以擴大研究范圍，從物理抑菌方面為柑橘綠色保藏提供理論參考依據。

參考文獻：

[1] 李小孟. 柑橘及其近緣屬植物的分子進化與栽培柑橘的起源研究[D]. 重慶：西南大學， 2010.

[2] 肖奕偉. 湖南柑橘品牌建設初探[J]. 湖南農業科學， 2018（7）：109-112.

[3] 韓 英. 柑橘的防腐保鮮貯藏處理[J]. 農家致富顧問， 2012（2）：29-29.

[4] Xu， D，Qin，H R，Ren， D. Prolonged preservation of tangerine fruits using chitosan/montmorillonite composite coating[J]. Postharvest Biology and Technology， 2008，143： 50-57.

[5] Zhang J， Si G G， Zou J， et al. Antimicrobial effects of silver nanoparticles synthesized by fatsia japonica leaf extracts for preservation of citrus"fruits [J]. J Food Sci，2017，82（8）：1861-1866.

[6] da Cunha T，Ferraz L P，Wehr P P，et al. Antifungal activity and action mechanisms of yeasts isolates from citrus against Penicillium italicum [J]. Int J Food Microbiol，2018，276：20-27.

[7] 閔曉芳， 鄧伯勛， 陳麗鋒，等. 柑橘采后致病青霉的鑒定[J]. 果樹學報，2007，24（5）：653-656，730.

[8] 閔曉芳. 柑橘采后致病青霉的分離鑒定及其生物學特性研究[D]. 武漢： 華中農業大學，2007.

[9] Schreuder W，du Plooy W，Erasmus A，et al. Postharvest fungicide treatments and cold storage control citrus black spot infections[J]. Crop protection，2018，112：332-342.

[10] Shi Z J，Wang F，Lu Y Y，et al. Combination of chitosan and salicylic acid to control postharvest green mold caused by Penicillium digitatum in grapefruit fruit [J]. Scientia Horticulturae， 2018，233：54-60.

[11] 張 良，劉媛潔，肖勇生，等. 響應面法優化柑橘復合生物保鮮劑配方[J]. 食品工業科技，2016，37（16）：340-345，356.

[12] 閔曉芳，陳麗鋒，鄧伯勛. 柑桔青綠霉病病原菌的分離及其生物學特性研究[J]. 中國南方果樹， 2007， 36（3）：11-14.

[13] 劉 瑜，王 海，王艷丹，等. 枸杞鮮果霉變菌種分離鑒定及其生物學特性[J]. 農業工程學報，2017， 33（s1）：374-380.

[14] 陶能國，王 華，王長鋒，等. 兩株柑橘采后致病真菌的分離及生物學特性研究[J]. 湘潭大學自然科學學報，2013，35（3）：75-78.

[15] 韓建榮，李智偉，王 宇，等. 一株產菌核青霉的生物學特性研究[J]. 山西大學學報（自然科學版），2009， 32（4）：634-639.

[16] 云 澤. 采后物理處理延長柑橘果實貯藏期的分子機理研究[D]. 武漢：華中農業大學， 2012.