?高速逆流色譜法分離黃柏中4種生物堿的方法研究?

摘 要：以黃柏粗提物中的生物堿在兩相溶劑系統中的分配系數K為依據，對正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇、丙酮、蒸餾水等進行不同的搭配組合，以篩選出最適合HSCCC分離黃柏中小檗堿、黃柏堿、巴馬丁和白瓜蔞堿4種生物堿的溶劑體系。結果表明：在檢測波長為280 nm，溫度為25℃，流速為2.0 mL/min，轉速為800 r/min的色譜條件下，以石油醚︰乙酸乙酯︰甲醇︰蒸餾水=5︰1︰2︰4的溶劑體系分離生物堿類物質的效果最佳，從50.70 mg黃柏粗提物中分離得到小檗堿22.10 mg、黃柏堿15.42 mg、巴馬丁0.80 mg和白瓜蔞堿0.20 mg，經HPLC分析其純度分別為98.27%、98.54%、97.55%和96.28%，回收率達到99.86%。

關鍵詞：高速逆流色譜法;黃柏;生物堿;分離;溶劑體系

中圖分類號：Q946.88 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2018）12-0082-06

Separation of Four Alkaloids from Phellodendron by High Speed Countercurrent Chromatography

LIU De-ming1，CHEN Miao-fen1，WANG Ying1，LIU Yong-xian2，WU Ke-bin1，DENG Na3

（1. Testing and Analysis Center， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Agricultural Resources and Environmental Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530000， PRC; 3. Henglong Traditional Chinese

Medicine Company of Longshan County， Longshan 416800， PRC）

Abstract： Based on the distribution coefficient K of alkaloids in the crude extract of phellodendron in two-phase solvent systems， different combinations of n-hexane， petroleum ether， ethyl acetate， 95% ethanol， methanol， acetone and distilled water were carried out to screen out the solvent systems that were most suitable for HSCCC （high speed countercurrent chromatography） separation of berberine， phellodendrine， palmatine and candicine from phellodendron. The results showed that： Under the chromatographic conditions of detecting wavelength at 280 nm， the temperature at 25 ℃， the flow rate at 2.0 mL/min and the speed at 800 r/min， the best effect was obtained when

the solvent system of petroleum ether∶ethyl acetate∶methanol∶water=5∶1∶2∶4 was used to separate alkaloids. 22.10 mg berberine， 15.42

mg phellodendrine， 0.80 mg palmatine and 0.20 mg candicine were isolated from 50.70 mg crude extract of phellodendron， and according to

HPLC analysis， the recovery rate reached 99.86% with the purity of 98.27%， 98.54%， 97.55% and 96.28% separately for the four alkaloids.

Key words： high speed countercurrent chromatography; phellodendron; alkaloids; separation; solvent systems

高速逆流色譜技術（High Speed Counter Current Chromatography，HSCCC）是當前國際上較新型的液-液分配技術，其工作原理建立在美國國立衛生院Yiochiro博士[1]發明的逆流色譜技術基礎之上，結合液-液分配原理，利用螺旋管的方向性與高速行星式運動，產生一種獨特的流體力學現象，使兩相溶劑在螺旋管中實現高效的接觸、混合、分配和傳遞，以相對移動的互不混溶的兩相溶劑，在動態平衡中將具有不同分配比的樣品組分分離。高速逆流色譜技術的特點是被分離物質在兩相液體中進行分配，不需要任何固相載體，克服了固相載體對樣品吸附造成的損失、污染、峰形拖尾等缺點，具有混合物分離回收率高、分離快速、預處理簡單、純化與制備同步完成等特點。因此，該技術越來越多地應用于天然產物的分離。

近年來，HSCCC在生物科學、醫藥、化工等領域[2]的研究較多。HSCCC在國內外已廣泛應用于分離植物中的有效成分，如生物堿類、黃酮類、萜類、木脂素和香豆素等[3]。黃倩倩等[4]采用正丁醇-乙酸乙酯-蒸餾水（4︰2︰5）的溶劑系統，從連翹葉中分離連翹酯苷，經HPLC鑒定含量為98.25%;孫印石等[5]以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-蒸餾水（2︰4︰3︰3）體系，從陳皮中分離純化得到黃酮，其純度達到97.0%;Liu等[6]采用HSCCC以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-蒸餾水（5︰5︰7︰5）為溶劑體系，從吳茱萸分離純化得到5種生物堿類化合物，純度均達95%以上;Chen等[7]采用正己烷-乙酸乙酯-蒸餾水-甲醇（1.5︰5︰5︰1.5）的溶劑體系，利用HSCCC分離純化丹參水溶性成分丹酚酸類物質，制備丹酚酸B化學對照品，其純度達98.6%;Lu等[8]采用HSCCC以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-蒸餾水（16∶14∶14∶5）為溶劑體系，從紫草粗提物中分離純化得到紫草素，分離純度高達98.9%，回收率達到了96.9%;Oka等[9]以叔丁基甲基醚-正丁醇-乙腈-蒸餾水（2∶2∶1∶5）為溶劑體系對蟲膠進行分離，得到4種乳酸，其純度經HPLC鑒定均達95.0%以上。

研究以黃柏粗提物中的生物堿在兩相溶劑系統中的分配系數K為依據，對正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇、丙酮、蒸餾水等進行不同的搭配組合，以篩選出最適合HSCCC分離小檗堿（A）、黃柏堿（B）、巴馬丁（C）和白瓜蔞堿（D）4種生物堿的溶劑體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃柏產地為湖南省湘西州龍山縣，以采用乙醇超聲提取法制備而成的黃柏初提物（實驗室自制）為原材料。

供試試劑有乙酸乙酯、正己烷（分析純，中國天津市巴斯夫化工有限公司），95%乙醇（分析純，天津市大茂化學試劑廠），石油醚（60～90℃）、丙酮（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司），甲醇（色譜純，湖南化工研究院精細化工研究所）。

供試儀器設備有HSCCC-TBE300A高速逆流色譜、TC-IO50恒溫循環器（上海同田生物技術有限公司），Aglilent1200型高效液相色譜（美國安捷倫科技有限公司），KQ-300TDB型高頻數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），SHB-III循環水式多用真空泵（鄭州市長城科工貿有限公司），RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶劑體系的初步篩選 以正己烷、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、甲醇、丙酮、蒸餾水為基本的溶劑，改變各溶劑的比例搭配出不同的溶劑體系（表1），將2 mg黃柏粗提物充分溶解于各體系之中，用HPLC方法測定黃柏粗提物中小檗堿（A）、黃柏堿（B）、巴馬丁（C）和白瓜蔞堿（D）4種生物堿在體系上下兩相中的分配系數K，從中選取比較合理的溶劑體系作進一步研究。

1.2.2 溶劑體系的配制以及分配系數的測定 以石油醚︰乙酸乙酯︰甲醇︰蒸餾水=5︰1︰2︰4的溶劑體系為例進行闡述，其他溶劑體系參照該操作。（1）溶劑體系配制：準確吸取10.00 mL石油醚、2.00 mL乙酸乙酯、4.00 mL甲醇和8.00 mL蒸餾水，共同放置于60 mL分液漏斗中，搖勻靜置5 min后分離上下兩相，分別存放于兩個10 mL錐形瓶中。（2）分配系數測定：吸取10.00 mL上相溶液置于60 mL分液漏斗中，往分液漏斗加入約2.0 mg黃柏粗提物，來回振動60次，靜置10 mim，吸取2.00 mL靜置后的上相溶液存放于小試管內，待液相色譜分析檢測;再加入8.00 mL下相溶液，來回搖勻，使黃柏樣品充分溶解于上下兩相溶劑中，靜置分層10 min，吸取2.00 mL靜置后的下相溶液存放于小試管內，待液相色譜分析檢測。因小檗堿（A）和白瓜蔞堿（D）的性質相似，兩者的分配系數K值也基本相近，所以試驗只檢測了小檗堿（A）、黃柏堿（B）、巴馬丁（C）在上、下相中的分配情況，并以峰面積之比求得3種物質的分配系數K=A上/A下。

1.2.3 HSCCC分離黃柏中4種生物堿的色譜條件和方法 （1）HSCCC色譜條件：檢測波長為280 nm，流動相體積流量為2.0 mL/min，轉速為800 r/min，溫度為25℃。（2）樣品制備：準確稱取適量的黃柏粗提物樣品，用上相充分溶解樣品，并用KQ-300TDB型高頻數控超聲波清洗儀超聲30 min。（3）HSCCC分離：待流動相和固定相達到動力學平衡之后，將超聲處理好的樣品倒入進樣口進樣，點擊程序開始信息采集，根據在線檢測情況分步收集流分。

1.2.4 HPLC檢測分離樣品純度 （1）HPLC分析條件：色譜柱為Vp-ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為V（甲醇）︰V（水）=65︰35，流速為0.8 mL/min，柱溫為35℃，進樣量為20 μL。（2）HPLC純度檢測：檢測HSCCC收集流分中的小檗堿（A）、黃柏堿（B）、巴馬丁（C）和白瓜蔞堿（D）的純度。

2 結果與分析

2.1 HSCCC溶劑體系的初步篩選

由表1可知，溶劑體系2、3、4、5、8、9、11、14、15、22的分配系數K值太大，表明HSCCC上出峰時間較慢，峰型變寬，耗費大量溶劑，不符合HSCCC進樣的條件（0.5

2.2 HSCCC溶劑體系的進一步優化

2.2.1 正己烷-甲醇-蒸餾水體系 以正己烷︰甲醇︰蒸餾水=6︰1.5︰4溶劑體系的上相為固定相，下相為流動相，將28.3 mg粉碎后的黃柏粗提物樣品溶解于5 mL固定相中，超聲處理使其充分溶解后，用于HSCCC試驗。高速逆流色譜條件：檢測波長為280 nm，溫度為25℃，流速為2.0 mL/min，轉速為750 r/min。

從圖1可以看出，在該溶劑體系下，只顯示一個吸收峰。按時間段分段收集流出液樣品進行HPLC分析，其結果如表2所示。因為小檗堿（A）與黃柏堿（B）的保留時間相差較遠，所以這2種物質比較容易用HSCCC分離;而小檗堿（A）與巴馬丁（C）的分配系數K相差較小，較難分離;小檗堿（A）與白瓜蔞堿（D）的分配系數K相差太小，無法分離;因此小檗堿（A）與巴馬丁（C）分離后，泵出液中主要為黃柏堿（B）。但從表2可看出，在750 r/min時，無論在哪一時間段都無法收集得到高純度的巴馬丁（C）。

為了提高巴馬丁（C）的純度，將分離轉速提高至800 r/min，如表2所示，由于黃柏粗提物在上下兩相萃取的時間更長，萃取更充分，因此體系在前10 min收集的流分中含巴馬丁（C）的百分比增大，而小檗堿（A）的百分比變小。這就說明提高轉速有利于小檗堿（A）與巴馬丁（C）的分離，更容易得到高純度的小檗堿（A）與巴馬丁（C）。同時，提高轉速可以使得出峰時間變慢，當體系轉速為750 r/min時，100 min就開始出現吸收峰;當轉速提高到800 r/min時，到130 min才有吸收峰的出現。盡管巴馬丁（C）的純度有所提高，但還是無法得到95%以上。因此，該體系還不是一個理想的分離體系。圖2是正己烷-甲醇-蒸餾水體系HSCCC分離得到的具備一定純度的樣品經HPLC檢測的圖譜。

2.2.2 正己烷-丙酮-蒸餾水體系 以正己烷︰丙酮︰蒸餾水=5︰3︰4溶劑體系的上相為固定相，下相為流動相，將46.5 mg的黃柏粗提物溶解于5 mL固定相中，超聲處理使其充分溶解后，用于HSCCC試驗。高速逆流色譜色譜條件：檢測波長為280 nm，溫度為25℃，流速為2.0 mL/min，轉速為800 r/min。由圖3可知，230～380 min的吸收峰還不是很對稱，說明小檗堿（A）與巴馬丁（C）還只是有了一定的分離趨勢。

由表3可知，在236～262 min時間段內收集的流分，巴馬丁（C）所占的百分比達到了80%以上，隨后時間段中其百分比逐漸降低，在305～389 min可以收集到97%左右的小檗堿（A）單體。

收集流分樣品的HPLC檢測結果如圖4所示，除小檗堿（A）與黃柏堿（B）以外，收集的其他2種物質的純度都低于95%。因此，該體系也不是一個理想的分離體系。

2.2.3 石油醚-乙酸乙酯-甲醇-蒸餾水體系 以石油醚︰乙酸乙酯︰甲醇︰蒸餾水=5︰1︰2︰4溶劑體系的上相為固定相，下相為流動相，將50.70 mg黃柏粗提物樣品溶解于7 mL固定相中，超聲處理使其充分溶解后，用于HSCCC試驗。高速逆流色譜條件：在檢測波長為280 nm，溫度為25℃，流速為2.0 mL/min，轉速為800 r/min。由圖5可知，230～380 min的吸收峰比較對稱，說明小檗堿（A）與巴馬丁（C）已經實現了很好的分離。

由表4可知，在石油醚-乙酸乙酯-甲醇-蒸餾水溶劑體系下，4種生物堿的分離效果較為理想;其中，78～88 min收集的分離樣品中，白瓜蔞堿（D）的含量為96.28%;222～260 min收集的分離樣品中，巴馬丁（C）的純度達到了97%左右;310～360 min收集的分離樣品中，小檗堿（A）的純度達到了98%以上;泵出液中，巴馬丁（C）的純度達到了98.54%。

圖6為該體系分離出的樣品經HPLC檢測的圖譜，通過面積歸一化法算得分離獲得的小檗堿（A）、黃柏堿（B）、巴馬丁（C）和白瓜蔞堿（D）純度分別為98.27%、98.54%、97.55%和96.28%，均達到了95%以上;同時，回收率達到了99.86%。這表明該溶劑體系實現了小檗堿（A）、黃柏堿（B）、巴馬丁（C）和白瓜蔞堿（D）的有效分離，是一個比較理想的溶劑體系。在該溶劑體系下，試驗最后從50.70 mg的黃柏粗提物中成功分離得到小檗堿（A）22.10 mg、黃柏堿（B）15.42 mg、巴馬丁（C）0.80 mg和白瓜蔞堿（D）0.20 mg。

3 討 論

研究采用高速逆流色譜法，以黃柏粗提物中生物堿在兩相溶劑系統中的分配系數K為依據，篩選出最適合分離黃柏中生物堿的溶劑體系。試驗結果表明：在檢測波長為280 nm，溫度為25℃，流速為2.0 mL/min，轉速為800 r/min的色譜條件下，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶蒸餾水=5∶1∶2∶4溶劑體系分離生物堿類物質的效果最佳，從50.70 mg黃柏粗提物中分離得到小檗堿（A）22.10 mg、黃柏堿（B）15.42 mg、巴馬丁（C）0.80 mg和白瓜蔞堿（D） 0.20 mg。經HPLC分析，小檗堿（A）、黃柏堿（B）、巴馬丁（C）和白瓜蔞堿（D）的純度分別為98.27%、98.54%、97.55%和96.28%，回收率達到99.86%。

參考文獻：

[1] Yoichiro I. Principal，apparatus and methodogy of high-speed count current chromatography[J]. Interscience Publication，1995，37（1）：110-112.

[2] 陳蘇偉，潘勇琴，蔡紀青. 高速逆流色譜法及其在中藥分離中的應用[J]. 天津藥學，2008，20（1）：74-76.

[3] 田亞平，袁志芳，張蘭桐. 高速逆流色譜技術在中藥與天然產物研究中的應用[J]. 河北醫科大學學報，2006，27（6）：591-593.

[4] 黃倩倩，朱占軍，潘瑞樂，等. 高速逆流色譜分離連翹中連翹酯苷[J]. 天然產物研究與開發，2008，20（B05）：61-63.

[5] 孫印石，劉政波，王建華，等. 高速逆流色譜分離制備陳皮中的黃酮類化合物[J]. 色譜， 2009，27（2）：244-247.

[6] Liu R M，Chu X，Sun A L，et al. Preparative isolation and purification of alkaloids from the Chinese medicinal herb Evodia rutaecarpa（Juss.）Benth by high-speed counter-current chromatography[J]. J Chromatogr A，2005，1074（1/2）：139-144.

[7] Chen J H，Wang F M，Lee F S，et al. Separation and identification of water-soluble salvianolic acids from Salvia miltiorrhiza Bunge by high-speed counter-current chromatography and ESI-MS analysis[J]. Talanta，2006，69（1）：172-179.

[8] Lu H T，Jiang Y，Chen F. Preparative high-speed counter-current chromatography for purification of shikonin from the Chinese medicinal plant Lithospermum erythrorhizon[J]. J Chromatogr A，2004，1023（1）：159-163.

[9] Oka H，Harada K I，Suzuki M，et al. Separation of spiramycin components using high-speed counter-current chromatography[J]. J Chromatography A，2000，903（1/2）：93-98.