腎衰方及其拆方對MMP7、α-SMA調節作用的探討

沈金峰，黃偉，晏子友

(江西中醫藥大學，江西 南昌 330006)

腎間質纖維化是各種腎臟疾病進展到終末腎衰的共同轉歸，是腎功能衰竭的主要病理表現。延緩腎臟疾病進展的主要方法是改善腎間質纖維化的病理變化。本研究采用單側輸尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)誘導腎間質纖維化小鼠模型，觀察了腎衰方對MMP7、α-SMA表達的作用及其抗腎間質纖維化的機制，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 動物分組與造模

SPF級雌性大鼠72只(購于浙江省醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號：SCSK(浙)20170001 )，體質量180～200 g，適應1周，尿蛋白陰性者方可使用。按體重隨機分為假手術組、模型組、腎衰方組、補虛方組、袪邪方組、貝那普利組，每組12只。UUO動物模型參照文獻[1]方法進行，即以5.0%水合氯醛(10 mL/kg體質量)腹腔注射麻醉后，于左側中腹部切開皮膚，游離左側輸尿管，分別在腎盂處和輸尿管上1/3處用絲線結扎后，切斷輸尿管，逐層縫合皮膚即可。假手術組僅游離左側輸尿管，不結扎及切斷輸尿管。

1.2 藥物與試劑

腎衰方組(生黃芪30 g，生地黃10 g，黨參15 g，山萸肉10 g，淮山藥15 g，丹參20 g，澤瀉10 g，土茯苓20 g，白花蛇舌草20 g，六月雪20 g，生大黃后下10 g，淫羊藿15 g,共12味中藥)、補虛方組(生黃芪30 g，黨參15 g，生地黃10 g，山萸肉10 g，山藥15 g，淫羊藿15 g,共7味中藥)、袪邪方組(生大黃10 g，丹參20 g，白花蛇舌草20 g，六月雪20 g，土茯苓20 g，澤瀉10 g,共6 味中藥)三組，所有中藥均由江西中醫藥大學中藥飲片廠專家鑒定后提供，常規方法水煎，分別濃縮成每毫升含生藥量1.2 g、0.4 g、0.8 g三種劑量，4℃冰箱保存。由江西中醫藥大學附屬醫院藥劑科制備。鹽酸貝那普利(商品名：洛丁新)由北京諾華制藥有限公司提供,規格10 mg/片，批號：H2003014。

兔抗大鼠MMP7單抗、兔抗大鼠α-SMA單抗均由武漢博士德生物工程有限公司提供，以1∶100稀釋。Masson染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、免疫組化超敏SP試劑盒由福州邁新生物技術開發有限公司提供；磷酸緩沖液(PBS)由檸檬酸緩沖液由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。

1.3 給藥方法

手術后第3天，各中藥組及貝那普利大鼠給藥均按10倍于臨床用藥劑量折算為等效劑量給藥，即腎衰方組、補虛方組和祛邪方組大鼠分別按分別按1.95 g/mL、0.95 g/mL、1.00 g/mL腎衰方濃縮劑給藥，即給藥劑分別為19.5 g/kg·d、9.5 g/kg·d、10.0 g/kg·d灌胃(均相當于成人劑的10倍)；予貝那普利組大鼠貝那普利1.5 mg/kg·d灌胃(相當于成人劑量的10倍)，假手術組和模型組大鼠給等量生理鹽水灌胃。各組大鼠分別于手術后第7天、第14天處死。

1.4 觀察與檢測方法

1.4.1 一般情況觀察

觀察各組大鼠飲食、體質量、計算左腎(術側)濕重、腎臟器系數(腎濕重/體質量×100%)；

1.4.2 腎組織學檢查

大鼠處死后，迅速取出術側腎臟，稱重。腎組織經4%福爾馬林液浸泡固定，脫水，石蠟包埋，制成約4 μm 厚切片，做HE及Masson染色，光鏡下觀察腎臟組織學變化。每組隨機取1只大鼠，活體取術側腎髓質一小塊(0.5 mm3)新鮮組織經2.5%戊二醛固定、1%鋨酸后固定，Epon812包埋，醋酸鈾-枸椽酸鉛雙染色，H-600型透射電鏡下觀察。

1.4.3 腎小管損傷程度評分及腎小管間質纖維化指數測定

HE染色評定[2]：光學顯微鏡觀察(×400 倍)，依據每個視野腎小管病變(腎小管上皮細胞空泡變性、腎小管擴張、腎小管萎縮、紅細胞管型、蛋白管型、間質水腫、間質纖維化、間質炎性細胞浸潤等)累及的小管數目評定腎小管間質損傷指數損傷按 Banff分級進行0～3級半定量計分。0分：腎小管結構正常，未見病變；1分：腎小管病變數目<3個；2分：腎小管病變數目3～5個；3分：腎小管病變數目>5個或腎小管結構消失。每張切片隨機選取 10個視野不相重疊的皮質處腎小管，每只大鼠選5張組織切片，最后取平均值。Masson染色半定量分析[3]：在400倍視野下，每只大鼠選取5張組織切片，每張切片隨機選取5個互不重疊的腎皮質處腎小管間質視野，取平均值。根據視野中膠原染色陽性面積占整個視野面積的百分比評定腎間質纖維化指數，標準如下：0分，纖維化陽性面積<2%；1分，纖維化陽性面積2%～10%；2分，纖維化陽性面積 11%～20%；3分，纖維化陽性面積 21%～30%；4分，纖維化陽性面積>30%。

1.4.4 免疫組化檢測

用SP法檢測實驗大鼠腎間質MMP7、α-SMA的蛋白表達。每組取8只大鼠的術側腎臟，嚴格按SP試劑盒說明進行免疫組化技術操作，用PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，蘇木素復染。免疫組化結果借助用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件進行計算機圖象分析。每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，對所選視野內的免疫組化陽性信號經計算機圖像分析，通過積分吸光度值反映蛋白表達的高低。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 一般觀察及病理檢查

外觀性觀察：模型組大鼠的皮毛松軟、灰暗，消瘦，厭食，少動。治療組大鼠的飲食、體質量、存活率、活動情況無顯著差異，但整體狀況均比模型組稍好。

肉眼觀察：假手術組大鼠腎臟表面光滑，顏色鮮紅，質脆柔軟。術后第7天、第14天無明顯變化；UUO大鼠造模術側腎臟體積大于對側，顏色變淡，剖面表現出缺血狀，腎皮質為尤為明顯。腎盂、腎盞擴張明顯，內含尿液，腎實質變薄，皮髓質邊界模糊不清。術后第7天變化不明顯，術后第14天出現明顯變化。模型組及各治療組大鼠術側腎臟顏色蒼白，有的可見一層薄萎縮樣纖維化腎組織，內有大量積水，乳頭呈空洞狀，腎濕重較假手術組減輕。非術側大鼠腎臟術后第7天、第14天較假手術組變化不明顯。各治療組大鼠腎臟在色澤、大小、質地、積水程度方面都較模型組略有好轉。

各組大鼠左側腎腎臟器系數(腎濕重/體質量×100%)比較：根據實驗結果，與假手術組，同時期模型組左腎臟器指數顯著降低(P<0.05)，說明左腎衰竭模型成功制備。與模型組相比，腎衰方及其拆方組和貝那普利組臟器指數升高(P<0.05)，其中第14天腎衰方組大鼠術側腎腎臟器系數明顯高于其他三個治療組，差異具有統計學意義(P<0.05)，結果見表1。

大鼠腎臟病理改變：HE染色見假手術組大鼠腎小球、腎小管結構清晰，腎小管排列緊密，腎小管周圍間質無增寬；模型組大鼠術后第7天起觀察到腎小管管腔擴張，腎小管周圍間質增寬、水腫并伴有大量炎性細胞浸潤，隨梗阻時間延長更加嚴重。但梗阻早期(術后第7天)腎小球結構相對完整，各治療組大鼠較同期模型組上述病變有所改善。模型組及各治療組較假手術組顯著降低(P<0.05)，模型組與治療組比較亦有顯著差異(P<0.05)，且第14天腎衰方組大鼠腎小管損傷程度評分低于其他三個治療組，差異有統計學意義(P<0.05),見表2。Masson染色見假手術組大鼠腎小球基底膜、系膜區及腎小管間質無明顯膠原沉積；模型組大鼠腎臟見增寬的間質充滿著大量藍紫色條索狀膠原，隨梗阻時間延長加重。各治療組大鼠較同期模型組膠原沉積明顯減少。模型組及各治療組較假手術組顯著降低(P<0.05)，模型組與治療組比較亦有顯著差異(P<0.05)，且第14天腎衰方組腎小管間質纖維化指數明顯低于其他三個治療組，差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表1 各組大鼠術側腎腎臟器系數變化比較

注：與同時期假手術組比較，*P<0.05；與同時期模型組比較,#P<0.05；與同時期其他三個治療組比較,※P<0.05

2.2 各組大鼠術側腎臟組織MMP7、α-SMA蛋白表達比較

如表3，MMP7蛋白在假手術組大鼠腎小管間質僅見于少量的陽性表達，造模后，腎小球系膜和基底膜也出現弱陽性表達。隨著手術時間的延長，MMP7表達減少，腎間質纖維化病理程度逐漸加重。經治療后，各治療組MMP7蛋白表達均有所增加，以腎衰方組更明顯，差異有統計學意義(P均<0.05)。術后第14天，腎衰方組>祛邪方>補虛方阻>貝那普利組增，差異有統計學意義(P<0.05)。假手術組大鼠腎皮質α-SMA蛋白表達較少；與假手術組相比，模型組大鼠術后第7天α-SMA蛋白表達顯著增多(P<0.05)，隨著梗組時間的延長，α-SMA蛋白表達的增多更明顯(P均<0.05)。治療后各治療組α-SMA蛋白的表達有所下降，以術后第14天更明顯(P均<0.05),尤以腎衰方組更佳(P均<0.05)。

表2 各組大鼠腎小管損傷程度評分及腎小管間質纖維化指數

注：與同時期假手術組比較，*P<0.05；與同時期模型組比較,#P<0.05；與同時期其他三個治療組比較，※P<0.05

表3 各組大鼠腎組織MMP-7、α-SMA蛋白表達

注：與同時期假手術組比較，*P<0.05；與同時期模型組比較,#P<0.05；與同時期其他三個治療組比較，※P<0.05

3 討論

我們團隊經過多年的臨床及實驗，認為腎纖維化的病機歸納為“虛”“濕”“瘀”“毒”四個方面，“虛”是始因，濕、瘀是腎纖維化微型癥積形成的病理基礎，而毒促進腎纖維化的進展。本病為本虛標實之證，本虛以脾腎虧虛為主；標實以濕濁、痰瘀、濁毒為主。在早期，標實為主，以祛濕泄濁，活血化瘀為法，到了晚期，正氣耗傷，當以扶正為主，補益脾腎，泄濁解毒。病機關鍵是“脾腎虧虛、濕濁內蘊，瘀毒閉阻”，故治療以益腎健脾、化瘀利濕、解毒泄濁為法。腎衰方正是依據此病機研制而成，由生黃芪、生地黃、黨參、山萸肉、淮山藥、丹參、澤瀉、土茯苓、白花蛇舌草、六月雪、生大黃、淫羊藿組成。方中用丹參易丹皮增強活血化瘀之功效，以黨參代人參補中益氣，合黃芪健運脾陽，布施精微，生地黃益陰血、山萸肉補肝腎、山藥健脾固腎滋精、澤瀉利水滲濕、茯苓健脾利水，諸藥合用既可益氣固腎澀精，以護其本；又可健脾補腎填精，以培其源，配以苦寒生大黃，泄濁毒、破積滯、行瘀血，使濁毒從腸胃而出、白花蛇舌草清熱解毒、六月雪健脾利濕，活血及溫而不燥的淫羊藿溫腎陽而補腎氣，全方組方嚴格，緊扣病機，益腎而不留邪，降濁而不傷正，補中有瀉，寓瀉于補，以標本同治之，具有益腎、解毒、化瘀的功效。 補虛方組(生黃芪、黨參、生地黃、山萸肉、山藥和淫羊藿共7味中藥)、袪邪方組(生大黃、丹參、白花蛇舌草、六月雪、土茯苓、澤瀉共6味中藥)，通過拆方進行治療，進一步佐證腎間質纖維化是否為本虛標實之證。

肌成纖維細胞與腎小管間質纖維化的發生關系最為密切，而腎間質固有成纖維細胞和腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞的表型轉化是肌成纖維細胞的主要來源之一，腎間質纖維化(RIF)以成纖維細胞的增生及膠原、各種連接蛋白等細胞外基質的沉積為主要表現。α-SMA是平滑肌細胞的標志蛋白，是間質成纖維細胞轉化為α-SMA的肌成纖維細胞關鍵步驟[4]，這是腎間質纖維化的發生的關鍵，也是導致腎間質纖維化的重要機制。本實驗結果顯示，模型組大鼠腎間質可見ECM大量沉積，α-SMA蛋白表達激活，腎臟器系數顯著降低，腎組織嚴重病理損害，出現腎間質纖維化。經治療后，α-SMA蛋白表達顯著減少，腎間質沉積的ECM明顯降低， 腎臟器系數顯著升高，腎組織病理檢查也有所改善，尤以腎衰方組治療效果最佳，腎衰方>祛邪方>補虛方>貝那普利。

MMPs直接以酶原的形式分泌到EMC中，并在正常生理條件下起到降解細胞外基質的功效。MMPs 的這一作用運用在預防或治療疾病，現已在各個系統疾病中被廣泛研究[5]。而MMP-7 是MMP家族中分子量最小的一類，有著強大的降解作用，包括構成基底膜的基質成分在內的細胞外基質。大量的研究證實，MMP-7 通過降解細胞外基質成分[6]。在腎纖維化小鼠模型中發現，通過抑制內皮細胞分泌MPP7進而抑制ECM降解，促進腎小鼠組織纖維化進程[7]。通過促進MPP7表達，從而對腎間質纖維化起到預防及逆轉作用。本實驗結果發現，模型組大鼠腎間質MPP7表達明顯降低，膠原沉積則顯著增多，經腎衰方治療后，可明顯上調MPP7表達量，從而減少膠原的過度沉積，腎間質纖維化程度降低。尤以腎衰方組效果更佳。腎衰方>祛邪方>補虛方>貝那普利。說明腎間質纖維化時，隨著藥物誘導蛋白表達的MPP7增加，也進一步證實了腎間質纖維化屬于本虛標識之證，治療需標本兼顧。

中藥腎衰方抗腎間質纖維化作用機制可能作用機制是通過誘導腎間質MPP7蛋白的表達，抑制α-SMA蛋白的表達，從而抑制ECM的積聚，延緩纖維化進展，且腎間質纖維化為本虛標實之證。