白血病細胞的定向誘導分化及PADI4在誘導分化中的作用

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(山東省醫學科學院基礎醫學研究所，山東 濟南 250062)

白血病是血液系統的常見病和多發病，其發生的主要機制是由于造血細胞在某一分化階段出現了分化障礙，不能繼續終末分化，而保留其惡性增殖的能力。通過藥物將白血病細胞定向誘導分化為成熟細胞或誘導細胞凋亡，從而達到治療的目的，是治療白血病的重要策略之一。這種療法的主要特點是選擇性誘導腫瘤細胞分化成熟后自然死亡，而對正常組織細胞沒有明顯毒副作用，因而定向誘導分化將成為白血病治療的重要手段或途徑。自惡性腫瘤細胞可以轉化為較成熟細胞的方法提出以來，腫瘤誘導分化療法引起了國內外學者的廣泛關注。國內外學者進行了大量的體外誘導分化實驗，建立誘導分化治療模式，研究白血病定向誘導分化關鍵機制，并在粒系細胞、單核-巨噬細胞、紅系細胞、淋巴細胞、以及樹突狀細胞(dendritic cell，DC)等定向誘導分化相關基礎與臨床研究方面都取得了較大的進展[1-3]。現將白血病細胞誘導分化研究及肽酰基精氨酸脫亞胺酶(peptidylarginine deiminase，PAD/PADI)在白血病細胞誘導分化中的作用機制綜述如下。

1 白血病細胞誘導分化

我國學者在體外實驗研究的基礎上，分別首創全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)和三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)治療急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的方法，并獲得成功[1]，開創了臨床誘導分化白血病細胞成功治療白血病的先例。ATRA成為目前國內治療急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocyticleukemia，APL)、骨髓異常增生等血液惡性疾病的臨床首選藥物。除此以外，有關其他類型白血病的治療至今沒有取得明顯的突破，主要原因在于缺乏相對特異的新型終末分化誘導劑，或者某些類型的白血病細胞難以發生終末分化[2]。因此，目前國內外學者把腫瘤誘導分化的研究重點轉移到了新型終末分化誘導劑的發掘和白血病分化關鍵機制的研究。誘導白血病細胞向粒系細胞、DC和巨噬細胞分化對白血病治療有重要意義，其誘導方法和機制是白血病治療研究的熱點。

1.1 誘導白血病細胞向粒系細胞分化

誘導白血病細胞向粒系細胞分化是臨床誘導分化治療的主要措施。ATRA通過與維甲酸受體結合，引起維甲酸受體低磷酸化，導致受體融合蛋白的快速降解，從而誘導抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell，APC)分化和促進急性早幼粒細胞白血病細胞結構、功能的恢復[3]，是目前公認的誘導治療急性早幼粒細胞白血病的首選藥物。其發揮治療白血病作用的主要機制是ATRA具有促進白血病細胞向粒系分化的功能。基于ATRA誘導的人早幼粒急性白血病細胞株(HL60細胞)模型，有研究發現ATRA可以促進HL60細胞內肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase，PAD/PADI4)的表達。PADl4可轉移到細胞核內，作為轉錄因子結合sox4的啟動子促進白血病細胞的粒系分化[4]。此外，ATRA誘導人急性早幼粒細胞白血病NB4細胞粒系分化, 促進CD11b表達，其作用機制為ATRA通過上調TRIM22表達，使其靶向結合eIF4E而發揮作用[5]。通過研究ATRA對白血病細胞的誘導分化作用機制及信號通路，發現PADI4和TRIM22有望成為治療急性早幼粒細胞白血病治療的新靶點。協同ATRA作用的效應分子在促進白血病細胞粒系分化中的研究也有一些報道。去泛素酶USP48可以促進ATRA誘導的急性早幼粒細胞白血病細胞分化[6]。星形孢菌素可以通過MEK/ERK信號通路增強ATRA對人白血病U937細胞向粒細胞系的分化[7]。另外，人類臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)能夠誘導APL衍生的NB4細胞系以及原代APL細胞的粒細胞分化，并且還以協同方式促進ATRA對白血病細胞誘導的分化[8]。通過高通量蛋白質組篩選ATRA對白血病細胞粒系誘導分化的作用靶點及其可能作用機制[9]，尋求新的治療靶點，為精準調控誘導白血病細胞的靶向分化奠定基礎。

1.2 誘導白血病細胞向樹突狀細胞分化

樹突狀細胞(DC)是抗原提呈能力最強的一類免疫細胞，調節固有免疫和適應性免疫應答，參與腫瘤特異性主動免疫應答。至今已了解有幾種可溶性因子如GM-CSF、白介素-3(interleukin-3，IL-3)、SCF和FLT3L等與DC分化有直接的復雜關系[10]。用內源的方法可將白血病細胞誘導分化成為DC。粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)聯合白介素4(IL-4)是誘導髓源性DC的經典方法，但這種方法在誘導白血病細胞向DC分化中的效果尚不滿意，存在誘導效率低、體內轉輸后不穩定、價格昂貴等缺點。中藥與白血病細胞來源的成熟DC的關系引起越來越多的學者關注。在GM-CSF/IL-4聯合適當濃度人參、附子的作用下，白血病細胞可以誘導分化為DC，能明顯增強白血病細胞源DC表型(CD1a、CD80、CD83、HLA-DR)的表達率、提高其刺激T淋巴細胞的增殖能力及培養上清液中IL-12的含量。人參皂苷Ro聯合細胞因子(GM-CSF與IL-4)促進人單核白血病細胞(THP-1)向DC分化的作用[11]。雖然體外可以誘導白血病細胞分化，但是卻只能使一部分白血病細胞分化為DC。在急性髓系白血病中常見的遺傳改變是FLT3的內串聯重復(ITD)。FLT3-ITD突變直接影響DC的發育，間接調節T細胞的穩態和調節性T細胞的擴增，這種效應可能會破壞免疫監視，并促進白血病細胞的發生[12]。遺傳性的變異可能是不能有效全部誘導白血病細胞分化為DC的一個重要原因。選擇合適有效的誘導因子和方法是促進白血病細胞向DC分化的關鍵。近年來，源于急性髓細胞白血病患者的同種異體DC疫苗治療白血病取得較好的治療效果[13]。因此，開發有效誘導白血病細胞源DC的技術與方法有望在白血病治療領域取得突破。

1.3 誘導白血病細胞向巨噬細胞分化

白血病細胞尤其是M0、M1、M2、M3、M4和M5型急性粒細胞性白血病細胞都可向單核-巨噬細胞誘導分化，并且單核-巨噬細胞具有抗腫瘤功能。因此，結合誘導分化療法和巨噬細胞的功能調控，將白血病細胞向巨噬細胞分化誘導具有重要意義。巨噬細胞是重要的免疫效應細胞，可極化為M1和M2型巨噬細胞。M1型又被稱為經典活化的巨噬細胞(classically activated macrophages)，由干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)或TLR激動劑(如LPS等)誘導，具有較強的殺傷病原微生物和腫瘤細胞的功能，可分泌TNF-α、白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-12等細胞因子，可誘導Th1型免疫應答[14]。M2型巨噬細胞，又被稱為替代活化的巨噬細胞(alternatively activated macrophages)，可分為M2a、M2b和M2c亞型[14]。M2a由IL-4、IL-13誘導，主要發揮促進創傷愈合的功能，可分泌CCL18、CCL22等趨化因子，高表達精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)、 Fizz1/Relma和YM1等基因，可誘導Th2型免疫應答。M2b由免疫復合物和TLR或IL-1R的激動劑誘導，主要發揮免疫調節功能，可分泌IL-10等細胞因子。M2c由IL-10、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)或糖皮質激素等誘導，主要發揮免疫調節功能，可分泌IL-10等細胞因子[14]。佛波酯PMA已被證實可通過促進TGF-β/SMAD信號的傳導誘導白血病細胞株K562細胞向單核/巨噬細胞分化[15]。雖然目前多種細胞分化誘導劑如佛波酯，維甲酸和hexamethylene bisacetamide(HMBA)等在細胞水平的實驗中有良好的誘導分化作用，但對機體副作用較多。此外，中藥重樓皂苷D能夠明顯上調慢性粒細胞白血病細胞株K562細胞表面分化抗原CD14的表達，誘導細胞向單核-巨噬細胞分化[16]。

2 肽酰基精氨酸脫亞胺酶白血病誘導分化中的研究

以往研究發現肽酰基精氨酸脫亞胺酶(peptidylarginine deiminase，PAD/PADI)在白血病誘導分化過程中起關鍵作用。肽酰基精氨酸脫亞胺酶(peptidylarginine deiminase，PAD/PADI)是催化精氨酸轉化為瓜氨酸的關鍵酶。人類PAD分別為PADI、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6，簇集在染色體1P36.13上。PAD主要參與蛋白質的翻譯后修飾，在Ca2+離子存在下能將蛋白多肽鏈中的精氨酸(Arginine)殘基催化成瓜氨酸(Citrulline)，在細胞分化、凋亡以及基因調控等方面發揮重要作用。其中，PADI4主要表達于造血組織，例如骨髓、脾和外周血的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞中。PADI4的cDNA編碼663個氨基酸，與其它PADI有50%～55%序列同源性。PADI4的高表達與細胞凋亡有關，而其低表達則與細胞分化有關。

2.1 PADI4和腫瘤

PADI4在白血病、結直腸癌、食管癌、乳腺癌等絕大多數惡性腫瘤患者血液中有特異性的高表達[17]，但在正常和良性腫瘤中不表達或者表達很低，表明PADI4與惡性腫瘤的發生、發展有關。PADI4通過調控細胞的凋亡在腫瘤中發揮作用，其發揮作用的機制主要是：(1)PADI4能夠作為p53、ELK1、p300、p21等的協同調節因子[18-19]，調節H2A、H3、H4組蛋白的瓜氨酸化[18]。PADI4將組蛋白H3甲基化位點的精氨酸轉變為瓜氨酸從而抑制H3甲基化，抑制p53對靶基因OKL38、p21、CIP1、WAF1等表達的調控，影響細胞凋亡和細胞周期[19]；介導H4精氨酶3的瓜氨酸化，導致DNA損傷部位染色質解凝，促進p53介導的細胞死亡。(2)PADI4可將抗凝血酶(antithrombin，AT)瓜氨酸化，抑制了AT對凝血酶的抑制活性，而凝血酶活性的升高可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。(3)纖維連接蛋白(Fibronectin，Fn)可與細胞外基質(extracellular matrix，ECM)、整合素受體、生長因子等相互作用，在細胞黏附、遷移、分化及增殖等方面具有重要的作用，PADI4可將其瓜氨酸化，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。瓜氨酸化的Fn與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的結合增強，而與整合素受體的結合能力下降，且不能誘導HL-60細胞凋亡。(4)PADI4也可通過對腫瘤細胞中細胞角蛋白(cytokeratin，CK)的瓜氨酸化干擾細胞凋亡進程。

2.2 PADI4參與白血病細胞分化的作用機制及信號通路

在研究ATRA誘導的HL-60細胞分化過程中發現PADI4具有調節造血祖細胞增殖的作用[20]。PADI4在白血病細胞HL-60粒系分化過程中有促進分化的作用[20]。調控PADI4活性狀態，有可能使之成為調節白血病細胞分化的新靶點。在白血病細胞的分化過程中，PADI4可能通過對下游蛋白或組蛋白H2、H3、H4的瓜氨酸化調控了細胞分化的關鍵基因或蛋白的功能。有研究表明，PADI4能夠催化H3組蛋白的瓜氨酸化，并且可以與c-myc基因上游的淋巴增強結合因子(lymphoid enhancer-binding factor 1)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase 1)結合，控制c-myc的表達，從而調控骨髓中多潛能祖細胞的增殖[20]。PADI4作為轉錄因子結合sox4啟動子序列，調控其表達。而sox4可以靶向PU.1—ETS家族轉錄因子的表達[4]。PU.1是調節巨噬和粒系細胞分化中的一種非常重要的轉錄因子，決定細胞的粒系/巨噬細胞分化。因此，PADI4可以通過PADI4-Sox4-PU.1這個途徑發揮調節白血病細胞的粒系/巨噬細胞分化的功能[4]。此外，PADI4還可以通過調控MAPK信號通路中p42/44蛋白磷酸化參與白血病細胞HL-60的粒系分化過程。PADI4有望成為治療白血病，調控白血病細胞分化的重要靶點。調控PADI4的表達水平，促進其在白血病細胞分化中的作用將為治療白血病提供新的研究思路。但目前調控PADI4活化的上游靶分子和信號通路尚不明確。除ATRA外，是否還有其他調控PADI4促進白血病細胞粒系分化的誘導劑尚待進一步研究。

3 展 望

現階段白血病分化治療仍具有挑戰性，存在多種問題尚未解決：(1)臨床可用藥物少、機制尚不完全清楚；(2)實驗室研發藥物在臨床應用中副作用大，效果不理想；(3)造成造血細胞分化功能異常的機制尚不完全清楚，遺傳變異是導致造成造血細胞分化異常和治療失敗的重要因素；(4)精準靶向分化特異抗原提呈細胞具有挑戰性和局限性。因此，深入研究造血細胞異常分化的機制，尋找靶向調控造血細胞定向分化的新靶點，尋求適用于臨床應用的靶向藥物以及誘導白血病細胞定向分化的新靶點將成為未來白血病治療研究的重點。近年來隨著表觀遺傳學和干細胞技術研究的發展，使尋求新的高效低毒的誘導分化因子用于治療白血病成為可能。通過調控決定白血病細胞分化的酶或轉錄因子，誘導白血病細胞特異分化，為精準靶向治療白血病提供一個重要研究方向。比如是否存在特異調控PADI4的上游靶分子，使之成為靶向誘導白血病細胞分化的新誘導分子。此外，microRNA、IncRNA在白血病細胞分化中的作用和潛在調節機制也逐漸受到關注，轉錄水平的調控對于精準靶向治療白血病具有重要意義。再者，改進誘導白血病細胞定向分化的治療方式方法的研究也將有助于提高白血病治療的療效。例如：協同聯合治療以加強誘導分化劑的誘導效果，減少機體對誘導分化劑的抵抗，選擇合適有效的誘導方法以提高分化效率等。