長鏈非編碼RNA在彌漫大B細胞淋巴瘤中的研究進展

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(南華大學衡陽醫學院腫瘤研究所；腫瘤細胞與分子病理學湖南省重點實驗室，湖南 衡陽 421001)

1 LncRNA

LncRNA是一類長度>200個核苷酸的RNA分子，最初在2002年由岡崎等人在小鼠中通過大規模測序發現并首次報道。由于lncRNA沒有明確的開放閱讀框架，它不參與或很少編碼蛋白質，使其在發現時就被認為是基因轉錄的“噪音”。LncRNA經歷剪接，聚腺苷酸化和5′加帽，從而與mRNA具有相似的結構，但lncRNA顯示出與mRNA明顯不同的特征，即lncRNA具有較少數量的外顯子和較高的組織特異性[1]。根據LncRNA在基因組的位置可以分為：(1)反義lncRNA；(2)內含子非編碼RNA；(3)基因區間的lncRNA；(4)啟動子相關lncRNA；(5)非翻譯區lncRNA。LncRNA可與DNA，RNA和蛋白質其中一種或多種相互作用，可大致分為：(1)lncRNA通過海綿吸附miRNA，從而調控靶基因表達；(2)lncRNA與蛋白質結合，調控蛋白質功能；(3)作為結構組分，與蛋白質形成核酸蛋白質復合物，例如lncRNA與蛋白質復合物，可結合到基因啟動子區域并調控基因的轉錄；(4)干擾鄰近蛋白編碼基因的表達；(5)抑制RNA 聚合酶Ⅱ，或介導染色質重構和組蛋白修飾，從而影響基因表達；(6)lncRNA可與基因的轉錄本形成互補雙鏈，并在Dicer酶作用下生成內源性的小干擾RNA(Small interfering RNA ；siRNA)，以調控基因的表達水平；(7)結合在特定蛋白上從而改變該蛋白的胞質定位[2]。近年來，隨著lncRNA成為研究熱點，已經發現一些異常表達的lncRNA在各種癌癥中扮演著重要的角色，如肝細胞癌(LncRNA-HEIH)，乳腺癌(lncRNA-HOTAIR)，前列腺癌(PlncRNA-1)和非小細胞肺癌(LncRNA-MALAT1)，已經證實這些lncRNA參與腫瘤的進程并且有望成為腫瘤標志物。而lncRNA在DLBCL中的作用也不斷被報道。

2 LncRNA與DLBCL發病機制的關系

2017年世界衛生組織預估美國2018年淋巴瘤的新發病人數及死亡人數中，NHL占比90%以上，而DLBCL是來源于B細胞的NHL，是成人NHL中最常見的類型，占所有NHL的35%～40%，占全球侵襲性淋巴瘤的80%以上[3]。根據DLBCL發生的細胞來源，可以將其分為二種亞型：(1)生發中心B細胞樣(GCB)DLBCL；(2)活化B細胞樣(ABC)DLBCL。大量研究表明lncRNA是DLBCL基因調控網絡的重要組成部分，88%的新型lncRNA的表達至少與一種蛋白質編碼基因相關[4]。DLBCL是一種極其復雜性的侵襲性疾病，由于在臨床表現、mRNA表達和基因突變等方面具有高度異質性的原因，Verma等[5]人通過對116例DLBCL組織和30例DLBCL細胞系的RNA測序(RNA-seq)數據進行分析，發現2 632個具有差異性的lncRNA，其中大約一半僅在DLBCL組織或細胞系中表達，且小部分病例中發現腫瘤特異性lncRNA；而這些差異lncRNA中有465個新型lncRNA可以用來區分ABC和GCB 型DLBCL。Zhou等[6]通過收集GEO數據庫中ABC-DLBCL及GCB-DLBCL的測序數據，發現156個具有特異性的差異lncRNA，與Verma等[5]人所發現的lncRNA沒有任何重疊，再次證明DLBCL的高度分子異質性，他們在這156個亞型特異性lncRNA中發現有17個lncRNA可以區分ABC和GCB型DLBCL，并稱其為subsigLnc-17，其特異性和敏感性約為90%。除了對DLBCL的上述亞型的分類研究以外，另一些基于此分類的研究報道DLBCL基因突變表達譜的文獻比比皆是，旨在尋找DLBCL發生發展的初始動力。GCB-DLBCL大約30%～40%存在t(14;18)易位，30%存在c-rel擴增，20%存在組蛋白甲基轉移酶EZH2的突變，并且10%存在PTEN的缺失；相反ABC-DLBCL的特征在于NF-κB信號通路的活化，從而促進細胞的存活及增殖，抑制細胞凋亡，因此更具侵襲性及較差的臨床預后；而抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2(BCL2)在GCB-DLBCL與ABC-DLBCL中均過表達[7- 8]。為了進一步明確lncRNA與DLBCL初始動力之間的關系，Verma等[5]人篩選出位于基因反復擴增區域并且同時過表達lncRNA，更深入地探討其與轉錄抑制因子BCL6和EZH2之間的共表達模式，發現323個和431個lncRNA分別與BCL6和EZH2的表達呈負相關，其中>40%的lncRNA是由EZH2或BCL6誘導的，認為其中一些lncRNA可能是BCL6或EZH2的靶基因。以上研究表明lncRNA是DLBCL發生的初始動力中至關重要的一部分，在DLBCL的發病機制中起潛在作用。Peng等[9]研究發現lncRNA LUNAR1在DLBCL細胞系與組織中過表達，通過qRT-PCR和Western blot等實驗觀察到在沉默LUNAR1的表達后，轉錄因子E2F1和細胞周期蛋白D1(cyclin D1)表達下調(E2F1在多種癌癥中呈現過表達模式，其高水平促進癌癥進程；cyclin D1是調節細胞周期的重要蛋白之一，在許多癌癥中過表達，通過結合并激活CDK4 / 6，進而磷酸化腫瘤抑制蛋白(Rb)，使細胞由G1期進入S期)；相反p21的表達增加(p21在多種癌癥中表達不足或缺失)，從而抑制細胞增殖，此項研究表明E2F1，cyclin D1和p21可能是LUNAR1的功能靶點。與此同時，他們還發現lncRNA HULC和lncRNA PEG10在DLBCL細胞中過表達，而基因間lncRNA- p21(lincRNA-p21)在DLBCL組中低表達，功能試驗發現HULC亦可通過cyclin D1和BCL2影響DLBCL細胞的增殖與凋亡，而PEG10的過表達與治療效果及預后呈負相關；在上調lincRNA-p21的表達后，明顯抑制DLBCL細胞的增殖，且與B癥狀(持續三天體溫>38 ℃，盜汗或者6個月內不明原因的體重下降>10%)、國際預后指數(IPI)評分顯著相關[10-12]。他們指出lncRNA LUNAR1、HULC、PEG10及lincRNA-p21有望成為DLBCL的腫瘤標志物。

3 LncRNA與DLBCL的耐藥性

在治療上，阿霉素是DLBCL的有效藥物之一，當癌細胞暴露于阿霉素時，可以誘導癌細胞上皮-間質轉化(EMT)，刺激細胞形態變化和耐藥性，進一步增強侵襲能力。蛋白LC3及p62是檢測自噬的常用標志物，而p62的表達水平與自噬呈負相關，而自噬的激活可以抑制EMT的發生[13]。Li及其同事發現LncRNA MALAT-1在DLBCL細胞系中過表達，下調MALAT-1能抑制DLBCL細胞的增殖和遷移侵襲，使細胞在G0/G1期阻滯；為了進一步探討MALAT-1在DLBCL化學敏感性中的作用，觀察到在下調MALAT-1后LC3-II/LC3-I蛋白表達升高，p62蛋白表達降低，表明下調MALAT-1后可激活自噬，抑制阿霉素誘導的EMT，從而降低對阿霉素的耐藥性，類似的結果在裸鼠體內也得到證實[14]，為后續DLBCL避免耐藥的相關研究提供新方向。

4 LncRNA與DLBCL的預后

IPI是以臨床特征為基礎，包括年齡(>60歲為1分)、乳酸脫氫酶水平(LDH，>正常為1分)、美國東部腫瘤協作組ECOG的體能狀況評分(2/3/4級為1分)、Ann-Arbor分期(III/IV為1分)、淋巴結外病變受侵數目或侵犯重要臟器(≥2個部位為1分)，上述五項IPI指標評分總和：0～1分劃分為低危組，2分劃分為中低危組，3分劃分為中高危組，4～5分劃分為高危組，它是鑒別DLBCL高危患者和個體化治療的最有力指標[8]。然而，IPI并沒有考慮DLBCL患者的分子異質性因素，即使IPI變量相同或相似的患者，他們的生存預后間差異有顯著性。Yan等[15]發現DLBCL組織與細胞系中的lncRNA HOTAIR過表達，且HOTAIR的表達水平與較高的IPI評分相關， HOTAIR的表達下調能使細胞停滯在G2/M期，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，建議HOTAIR可用作預后指標。另一項研究通過提取GEO數據庫中微陣列數據集，分析了1 043名DLBCL患者的lncRNA表達譜，從高危組和低危組患者中發現6個lncRNA(SACS-AS1，MME-AS1，CSMD2-AS1，RP11-360F5.1，RP11-25K19.1，CTC-467M3.1)存在顯著差異，并將這6個lncRNA組合到基于6-lncRNA的形式命名，通過使用單變量Cox回歸分析發現6-lncRNA與DLBCL患者的總生存(OS)顯著相關，且6-lncRNA可以預測與IPI變化相同或相近患者的生存情況，提示6-lncRNA有望成為輔助IPI在分子水平上的預后指標[16]。由于DLBCL患者采用目前的標準治療利妥昔單抗-環磷酰胺-阿霉素-長春新堿-潑尼松龍免疫化療方案(R-CHOP)，CHOP治療或針對基因突變的靶向治療，其中50%的患者出現耐藥，甚至疾病復發，約三分之一的患者最終死于疾病，而上述研究報道的這些lncRNA可以為深入研究DLBCL的發病分子機制提供新思路，同時為DLBCL診斷、治療及預后提供新的方向。見表1。

表1 LncRNA在DLBCL中的研究總覽

5 展 望

自2011年第一次報道了全基因組lncRNA表達譜以來，目前基因注釋在人類基因組中存在15 000至60 000個lncRNA，大約70%的lncRNA在物種間保守性很差，這就要求研究時要使用原代細胞，人源化動物或靈長類動物模型，有助于更深入的了解其在體內功能及其與其他分子之間的相互作用。而GWAS的研究揭示了染色體區域內被稱為“基因沙漠”的SNPs，可能與lncRNA的功能有關，最近研究顯示26%疾病相關的SNPs(n=11,194)與lncRNA相關聯的，而最明顯的淋巴瘤相關SNP位于8q24的PVT1基因座上[17]。同時，大量證據表明lncRNA參與淋巴瘤的形成及淋巴瘤細胞的生物學行為。它們在細胞中的高度特異性表達模式使它們有望成為潛在的新型腫瘤標志物。

在過去的十年中，研究lncRNA的技術取得了很大的進展。如采用CRISPR-Cas9或反義寡核苷酸(ASO)技術來實現共轉染敲低，應優于常規RNAi方法；可以使用常規蛋白質-免疫沉淀(IP)或新穎的lncRNA-IP技術，如RNA純化染色質分離技術-CHIRP來研究LncRNA與蛋白質之間的相互作用。最后，RNA-熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技術已經開發出來可視化活細胞中的單個lncRNA分子[18]。此外，lncRNA數據庫不斷增長，通過評估lncRNA與已知蛋白質的共表達網絡來確保lncRNA整合到系統生物學中。總之，lncRNA作為DLBCL發生發展的主要參與者正在被迅速挖掘。一些lncRNA顯示出作為治療靶標的潛力，特別是那些積極參與化療效果介導的靶分子，努力開發可以特異性破壞lncRNA與蛋白質相互作用的小分子抑制劑。隨著基于反義寡核苷酸的療法逐漸走向臨床，特異性靶向lncRNA治療將會是一種很有前景的新方向。