大面積重度燒傷患者CyclinB1、CyclinC及PCNA表達特征分析

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(襄陽市中心醫院，湖北文理學院附屬醫院整形美容科，湖北 襄陽 441021)

燒傷是指由熱液、蒸氣等所引起的組織損害[1]，嚴重者也可傷及皮下或/和黏膜下組織，根據燒傷面積及嚴重程度可將其分為不同程度的燒傷[2]。燒傷導致人體的第一道防疫屏障遭到破壞，同時腸道的機械、生物、免疫三大屏障功能亦遭到損害，機體內環境紊亂，各組織臟器灌注不足，炎癥介質釋放等，都為各種微生物的入侵提供了可能，這不僅導致皮膚組織的損傷，處理不當時病情更趨危重，易引發一系列并發癥[3]。有研究發現[4-6]，細胞周期蛋白B1(CyclinB1)、細胞周期蛋白C(CyclinC)、增殖細胞核抗原(PCNA)的表達與細胞增殖有關，能加快細胞增殖，促進創面的愈合情況，本研究分析大面積重度燒傷患者創面組織中細胞周期蛋白CyclinB1、CyclinC以及增殖細胞核抗原(PCNA)的表達情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究中所有研究對象均來自我院收治大面積重度燒傷患者，收治時間均在2017年1月—2018年1月，根據納入標準，共收集患者83例，根據患者預后情況分為生存組和死亡組。其中生存組45人，死亡組38人，生存組中男孩25例(60.87%)，女孩18例，平均年齡為(10.6±2.1)歲；死亡組中男孩16例(71.01%)，女孩13例，平均年齡為(9.3±2.7)歲。通過假設檢驗的，生存組患兒與死亡組患兒之間的所有基本資料的差異均無統計學意義(P>0.05)，結果見表1。收集所有患者的基本資料，主要有年齡、性別、燒傷總面積等信息，對其基本情況進行比較，并采集患者在治療期間的不同時間的創面標本備用?；颊呒{入標準：①患者經過診斷，確定為大面積重度燒傷患者；②患者年齡為16～60歲；③燒傷總體表面積(total body surface area,TBSA)≥50%；④獲得患者同意?；颊吲懦龢藴剩孩贌齻麜r患者伴有胸腹部重要臟器損傷及嚴重顱腦外傷；②患者既往合并有重要臟器嚴重疾病；③臨床資料記錄嚴重不全者；④診療不配合者。根據納入標準和排除標準，將納入研究的83例患者根據患者病情發展情況分為不同組別，并收集所有患者的基本信息及相關指標。

表1 生存組與死亡組患兒間基線資料的比較

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 將83例大面積重度燒傷患者根據病情發展情況和結局分為生存組和死亡組。收集所有患者燒傷面積及傷后第1、2、3、5、7、9、13天，距離創面邊緣0.5cm處的創面標本，為避免影響愈合，每次取創面標本盡量避免破壞焦痂、結痂處，且對糜爛、化膿處及時予以消炎抗菌處理，每次取創面積約為0.3×0.3 cm。采用4%多聚甲醛將創面組織固定，石蠟包埋，備用。

1.2.2 標本制備 所有采集標本經石蠟包埋，4 μm切片。切片常規脫蠟、脫水，通過蘇木精—伊紅染色法(HE)對樣本行病理組織切片觀察。通過免疫組織化學法染色，石蠟切片常規脫蠟，采用3%的過氧化氫溶液常溫孵育20 min。水洗3次。用于PCNA檢測的染色切片置于pH為6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液中進行5min抗原微波修復，用PH為7.2的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，之后加入1∶200的PCNA一抗，常溫孵育2h；用于CyclinB1和CyclinC檢測的染色切片經EDTA高壓抗原修復2min，用PBS洗滌3次，之后分別加入1:50稀釋的CyclinB1一抗和1:200的CyclinC一抗，常溫孵育4h，滴加由生物素標記的二抗，常溫孵育40min，PBS洗滌3次，通過DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片等備用。

1.3 觀察指標

采用400倍光學顯微鏡下觀察制片結果，每個切片隨機選擇5個視野，運用德國全自動圖像分析系統(KONTRON IBAS2.5)進行免疫組化染色的定量分析，從而計算平均陽性單位值(PU)[7]。最后，觀察比較兩組患者的切片結果，判斷兩組之間的差異是否具有統計學意義。

1.4 統計學分析

通過Excel軟件對所有患者的資料，進行錄入和處理，運用SPSS17.0，選擇恰當的統計指標對患者基本資料進行統計描述；采用χ2檢驗對兩組患者的基線資料進行比較，判斷其是否均衡可比；通過t檢驗、方差分析或χ2檢驗等方法比較兩組患者創傷標本的檢測結果，判斷差異是否具有統計學意義。無特殊情況下P<0.05，表示具有統計學差異。

2 結 果

2.1 兩組創面肉芽組織特征

兩組第13天肉芽組織的HE染色病理切片結果見圖1。死亡組肉芽組織較多，具有更多的炎性細胞、有較多的炎性細胞浸潤(如白色箭頭所指)核固碎等。

圖1 生存組與死亡組患者病理組織特征結果

2.2 兩組患者CyclinB1的檢測結果

首先檢驗兩組患者在不同治療時間的CyclinB1的檢測結果分布情況，發現檢測結果近似服從正態分布，采用兩獨立樣本t檢驗對檢測結果進行比較。結果顯示，患者創傷治療后的第1、2、3、5、7天時，兩組患者CyclinB1的檢測結果間的差異具有統計學意義(均有P<0.05)，并且在生存組中，治療后第3天的CyclinB1水平達到峰值(圖2.1)，而死亡組在第5天才達到峰值。結果見表2。

表2 兩組患者CyclinB1比較

2.3 兩組患者CyclinC的檢測結果

研究結果顯示，在治療后的第1、2、3、5、7天時，兩組患者創面標本中CyclinC的檢測結果間的差異具有統計學意義(均有P<0.05)，9天和13天時，差異無統計學意義(均有P>0.05)，另外在生存組中，治療后第2天的CyclinC含量達到峰值(圖2.2)。具體情況詳見下表3。

2.4 兩組患者PCNA的檢測結果

通過統計學分析比較兩組患者在住院后不同時間的PCNA的檢測結果。結果顯示，在治療后的第2、3、5、7天時，兩組患者創面標本中PCNA的檢測結果間的差異具有統計學意義(均有P<0.05)，且在1、9和13天時，兩組患者標本中PCNA的檢測結果差異無統計學意義(均有P>0.05)；在生存組中，治療后第2天的PCNA含量達到峰值(圖2.3)，而死亡組在第3天達到峰值，且最高含量仍低于生存組。具體情況詳見下表4。

圖2 生存組與死亡組患者CyclinB1，CyclinC和PCNA結果

表3 兩組患者的CyclinC比較

表4 兩組患者的PCNA比較

3 討 論

燒傷是中國較為常見的一種意外傷害，雖然近些年來醫療技術得到了快速的發展，大大提高了燒傷患者的生存率，而大面積燒傷，通常使得人體防御體系的第一道防御屏障受到破壞，并且影響腸道的機械、生物以及免疫功能，常導致機體內環境紊亂，各重要組織臟器血灌流量不足，釋放各種炎癥因子，神經內分泌功能及免疫功能紊亂，并且感染機率明顯提高，通常情況下患者病情會日趨嚴重，因此，目前大面積重度燒傷成為燒傷治療和研究的重點[2]。

皮膚燒傷創面的愈合是一種較為復雜的生物學過程，主要包括炎性反應、細胞增生等基本過程[8]，而創面的愈合又受多種外界及內在的影響和調控。細胞周期是細胞增殖和細胞生命活動的基本過程，而細胞周期蛋白的合成與分解在真核生物細胞周期的調控中起著至關重要的作用。cyclin在細胞周期內是不斷變化的，cyclin與細胞周期蛋白依賴激酶結合后成為具有活性的二聚體，進而調控細胞周期的進程[9]，研究發現，細胞周期蛋白B1與細胞周期蛋白G1是細胞分裂，生長過程中重要的調節因子，是細胞周期蛋白中較早發現并且在G2-M期產生重要作用的蛋白分子[15-16]。CyclinB1在細胞周期中的S晚期的細胞漿中，當CyclinB1轉送至細胞核時，細胞進入G2期，因此認為CyclinB1在細胞周期中的G2或M期起到重要的調控作用[10-12]，另外，CyclinC只表達于細胞周期的G1期中點，并在G1期發揮重要作用[10]；PCNA是分子量為36KD的酸性蛋白，主要表達于細胞周期中的S期，參與DNA的合成，存在于細胞核內且在細胞核內合成，細胞周期中反映DNA的復制、合成狀態，因此僅在增殖細胞的細胞核中表達，是判斷腫瘤細胞增殖狀態的標志物及良好指標[13-14,18-19]。在組織形成期(創傷后2～10天)，創面愈合中關鍵的效應細胞—成纖維細胞迅速增殖，合成大量胞外基質，填補組織缺損,創面細胞周期蛋白B1(cyclin B1)和增殖細胞核抗原(PCNA)表達，可以增加S+G2期細胞數目，從而加快創面細胞增殖，促進創面愈合[17]。

本文研究結果顯示，大面積重度燒傷患者在燒傷后治療期間，創面標本中的CyclinB1、CyclinC和PCNA含量是不斷變化的。并且在1、2、3天和5天時，兩組患者CyclinB1和CyclinC的檢測結果差異均具有統計學意義(均有P<0.05)，且生存組分別在第3天和第2天含量達到峰值，與死亡組相比明顯提前，而PCNA在兩組中的檢測結果在2、3、5和7天時的差異有統計學意義(均有P<0.05)，生存組在第2天時含量達到峰值；另外，三個檢測指標的檢測峰值在生存組均明顯高于死亡組，這很可能與細胞增殖速度，創面愈合情況相關[5]。根據本文結果表示CyclinB1、CyclinC和PCNA含量對患者的預后情況具有一定的評估價值，可作為大面積重度燒傷患者預后情況的指標。