成纖維細胞生長因子18對骨和軟骨發育

，*， ，

(1.南華大學附屬第一醫院檢驗科，湖南 衡陽421001；2.中國科學院分子細胞科學卓越創新中心/生物化學與細胞生物學研究所,上海 200031；3.南華大學衡陽醫學院轉化醫學研究室,湖南 衡陽421001)

成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor，FGF) 家族是一組多功能信號分子，由22種結構相關蛋白質組成，其中的18種能夠作為配體結合到4種酪氨酸激酶受體上，另外4種(FGF11-14)屬于胞內蛋白不與受體反應。FGF存在于多種動物中，包括線蟲、斑馬魚、老鼠和人類等，能調控細胞的增殖、分化和遷移，與機體的器官形成、組織重塑、神經調控、血管生成和代謝調節有著密切的關系。FGF家族成員雖然結構相似，但表現出不同的分泌方式、作用機制和生物學效應。因此，它們被進一步分成幾個亞家族。FGF18由Ohbayashi等人首先發現，它在結構上與FGF8和FGF17最為相似，歸屬于一個亞型，是成人肺和正在發育的組織中的一種分泌信號分子。FGF18作為FGF家族中具有代表性的因子，在骨骼發育、軟骨形成和關節軟骨修復中起著關鍵作用。

1 FGF18的受體

目前已知的有四種FGF受體(Fibroblast growth factor receptor，FGFR)，FGF配體能與細胞表面FGFR的硫酸乙酰肝素鏈結合，誘導受體二聚化，傳遞下游信號。FGF的功能與FGF受體表達的時間和空間密切相關。

FGFR1和FGFR2表達于發育的肢芽和骨中，并表現出相似的信號傳遞效應。肢體間充質FGFR1和FGFR2的失活將會導致嚴重的骨骼發育不全。FGFR3則在增殖和預肥大的軟骨細胞中表達，抑制出生后軟骨發育。軟骨細胞FGFR3功能失活后的小鼠、綿羊和人表現出骨骼的過度生長，而FGFR3激活則會導致軟骨的發育不全和異常[1]。在成骨前體細胞中特異性敲除Fgfr1和Fgfr2后，該小鼠出現嚴重的出生后缺陷，包括體重減輕、骨量減少、縱骨生長受損，生長板總長度和增殖軟骨細胞帶的長度明顯縮短[1]。另外，該小鼠出現的軟骨發育受損的表型，包括軟骨細胞增殖減少，基質破壞，肥大區縮小等，作者認為這是由于FGF9和FGF18的代償性上調，從而激活FGFR3負調控軟骨發育導致的。但也有研究認為FGFR3能被FGF18激活，促進未成熟的增殖軟骨細胞分裂，而缺乏FGF18的小鼠軟骨增殖則受到抑制[2]。

FGF18通過作用于FGFR4來調節自噬，進而影響軟骨基質的產生。生長板軟骨細胞在出生后的發育過程中會誘發自噬，自噬能調節Ⅱ型膠原(Collagen typeⅡ,Col2)的分泌，而Col2是軟骨細胞外基質的主要成分[3]。而缺乏自噬相關基因7小鼠的前Ⅱ型膠原(typeⅡ procollagen，PC2)大量存儲于內質網中未釋放，而導致軟骨細胞外基質中的Col2纖維網形成缺陷。 這些結果說明自噬參與了軟骨細胞的發育，接著他們證明了FGF18通過影響自噬，參與了這一過程。隨后他們發現沉默Fgfr3和Fgfr4可以抑制FGF18對自噬的誘導作用，但是沉默Fgfr1和Fgfr2沒有出現這一現象，并且只有Fgfr4敲除小鼠LC3水平降低。

2 FGF18相關信號通路

FGF與受體結合后會在質膜上形成一個三分子復合物，從而激活下游分子并傳遞信號。FGF信號通路是脊椎動物骨骼發育的重要調節因子，對骨和軟骨發育、骨礦化的動態平衡等都起著關鍵作用[2]。FGF18相關信號通路總結于表1。

表1 FGF18相關信號通路

有研究發現，PHLPP1能抑制軟骨細胞的增殖、分化和基質的產生，從而影響軟骨內骨化。Phlpp1-/-小鼠Akt2活性增強，轉錄因子FoxO1水平降低，促進FGF18表達，從而通過FGFR2刺激ERK1/2的磷酸化，促進軟骨細胞的增殖[4]。關節間區細胞的Hedgehog信號能選擇性地抑制β-catenin誘導的FGF18表達，從而引起一系列關節形態的改變，影響關節軟骨發育并誘發相關疾病[5]。小鼠軟骨細胞中選擇性敲除核轉錄因子7類似物2(transcription factor 7 like 2，TCF7L2)顯性負性突變亞型(也稱為dnTCF7L2)基因可以消除Hedgehog信號誘導的FGF18下調，故Hedgehog信號可能通過dnTCF7L2來調節β-catenin基因。另外，在小鼠骨關節炎(OA)模型中，β-catenin的激活可以削弱Hedgehog信號誘導的或手術誘導的關節軟骨退化。這些結果說明，Hedgehog通過選擇性抑制β-catenin靶基因的表達，直接影響了關節間區細胞以及關節軟骨的發展和疾病。

在對骨發育的研究中，FGF18通過上調成骨層骨形態發生蛋白2(Bone morphogenetic protein2，BMP2)加速成骨過程[6]。他們在小鼠胎兒體內植入重組人成纖維細胞生長因子18(Recombinant human fibroblast growth factor18, rhFGF18)后發現BMP2特異性上調，而BMP拮抗劑rmNoggin可以抑制rhFGF18對成骨標志物的刺激作用。Mahapatra，等提出膠原蛋白中一種介孔性質的生物活性玻璃納米載體能大量穩定地釋放FGF18，FGF18能與間充質干細胞表面的BMP2結合，刺激下游信號分子Smad1/5/8的分泌，從而加速骨發育和骨基質的形成[7]。

前文已經提到自噬影響軟骨細胞外基質形成，且FGF18參與了這一過程。有研究發現，Fgf18半敲小鼠與WT小鼠MAPK通路中各因子的活性，結果發現只有c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的活性減低。之前文獻已經報導過活性的JNK1可以磷酸化B-cell lymphoma-2(bcl-2)，使bcl-2與beclin-1分離，形成vps34-beclin-1復合物。研究者通過一些實驗對這一通路進行了驗證，隨后對Fgf18半敲小鼠腹腔注射beclin-1激活劑，發現該小鼠的自噬恢復了正常。這表明FGF18能夠通過調節MAPK通路中的JNK1來影響自噬，從而影響軟骨細胞外基質的形成。

3 FGF18和骨骼發育

3.1 骨發育

脊椎動物有膜內骨化和軟骨內骨化兩種成骨方式，膜內骨化是由間充質干細胞直接分化成骨原細胞，而軟骨內骨化則是先在肢芽中形成初級骨化中心和次級骨化中心，再逐漸由骨組織取代。FGF18在這兩種機制中都起著重要作用。

大部分研究認為FGF18對骨發育起正向刺激作用。Fgf18全敲小鼠骨骼發育異常，骨化延遲，且出現胚胎致死，且該小鼠肱骨骨橋蛋白和骨鈣素表達降低，股骨核心結合因子a1在骨小梁處表達降低，提示FGF18參與成骨細胞的成熟和增殖[8]，且該小鼠表現出的延遲骨化與軟骨細胞肥大延遲啟動、軟骨形成早期增殖減少、骨骼血管化延遲、破骨細胞和成骨細胞向生長板聚集過慢等有關。有觀察發現[9]，在大鼠骨髓間充質干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs)中加入rhFGF18后，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的水平和礦化水平明顯上升，成骨分化標志Col1a1,Bmp4,Runx2的表達增加，這說明FGF18誘導了rBMSCs的成骨分化。細胞活力分析顯示，FGF18提高了rBMSCs的增殖活性，且隨劑量上升。Nagayama等[6]采用子宮手術將rhFGF18植入到小鼠胎兒的冠狀縫上以探討促成骨作用的機制。冠狀縫區包括發育中的額骨和頂骨的邊緣部分，且由縫隙間充質隔開。rhFGF18通過促進額骨與頂骨結構域的連接而加速了骨的形成，使得縫隙間充質消失。

與之前觀點相反的是Zhai等[10]認為FGF18對骨發育起負調節作用。他們在含有FGF18的成骨培養基中培養MC3T3-E1細胞，第7天和第14天時ALP活性明顯降低，成骨相關基因包括Alp, Col1a1,骨鈣蛋白(Ocn)，骨唾液蛋白(Bsp)等的表達明顯被抑制。另外，該細胞的礦物沉積也明顯降低。

3.2 軟骨發育

軟骨是一種由軟骨細胞組成的特殊結締組織，這些軟骨細胞嵌入在含有膠原、蛋白多糖和非膠原蛋白的細胞外基質中。根據軟骨類型的不同，細胞外基質的含量也不同，透明軟骨和彈性軟骨主要含有Ⅱ型膠原(Collagen typeⅡ,Col2)，而纖維軟骨主要含有Ⅰ型膠原(Collagen type Ⅰ，Col1a1)。

一些研究表明FGF18能促進軟骨細胞的增殖和基質的產生。Mori等[11]用微陣列分析比較了大鼠四種軟骨基因表達的差異，其中包括成年鼠的關節軟骨(Adult articular cartilage，AA)、成年鼠的生長板軟骨(Adult growth plate cartilage，AG)、幼鼠的表層軟骨(Infant superficial layer，IS)和幼鼠的深層軟骨(Infant deep layer，ID)。結合逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(Reverse transcriptionquantitative polymerase chain reaction, RTqPCR)結果，他們篩選出16種基因在AA和IS中的表達高于AG和ID。在這些基因中同源異型盒基因D10、內皮細胞特異性分子-1和FGF18在AA中的表達高于IS。它們中FGF18的AA/AG比最高，且FGF18能明顯降低小鼠股骨頭軟骨黏多糖(Glycosaminoglycan，GAG)的釋放與耗竭，提高關節軟骨細胞的增殖能力。

Gigout等在細胞水平上分析了rhFGF18(又稱Sprifermin)對關節軟骨細胞的作用[12]，發現不同濃度的Sprifermin培養豬軟骨細胞后，軟骨細胞數量明顯增加，總GAG、Sox9的水平隨劑量增加，而Col1a1水平降低。且隨著Sprifermin濃度的增加，軟骨細胞不再表現為拉長的形態，而是逐漸變成了圓形，通過間歇性給藥、持續性給藥以及僅一次給藥三種方式比較，間歇性給藥能使細胞數量、細胞外基質產量、兩種膠原的比例、Sox9的表達得到的更明顯的改善，在人受損關節軟骨，按受損程度輕重分為三組，Sprifermin處理后與之前實驗結果基本相一致，而受損最嚴重的一組Sprifermin治療效果相比之下不如受損較輕的組好。這些結果可以說明FGF18正向調節軟骨細胞的增殖。但也有研究認為FGF18負調控軟骨發育。Liu等[8]發現Fgf18全敲小鼠胚胎生長板增殖區和肥大區擴大，增殖區Brdu摻入量增加和肥大區COLX表達增加，提示FGF18對軟骨細胞的增殖和分化的作用是負向的。

4 FGF18與軟骨相關疾病的治療

關節軟骨主要由無血管的Col2和蛋白多糖基質組成，成人的這種基質是由相對較少的軟骨細胞分泌和維持的，因此關節軟骨的修復能力非常有限。創傷或感染引起的局灶性病變如果不能完全痊愈，就很容易迅速發展為骨關節炎。生長因子是機體產生的一組具有生物活性的多肽，能刺激細胞分裂、生長和分化。生長因子為局部關節軟骨缺損或更廣泛的軟骨缺損(如骨關節炎)的軟骨再生提供了新的治療方法。許多生長因子在軟骨的損傷修復和骨關節炎的發展種起著非常重要的作用，其中就包括FGF18。

4.1 骨關節炎的治療

Reker等[13]用牛關節軟骨和臨床試驗證明Sprifermin確實能影響關節軟骨的代謝，包括細胞的增殖，增加代謝活性和Col2的產生。但在關節軟骨預先激活炎癥反應后這一效果就消失了，因此他們推測Sprifermin對骨關節炎的治療依賴于炎癥發生之前。Mori[11]等對大鼠施行半月板撕裂術誘發骨關節炎，術后三周開始進行關節內注射rhFGF18。實驗組分為兩類，一類每周注射一次持續三周，另一類僅注射一次。對照組從術后6周開始出現關節損害，至9周更加嚴重。連續注射組與對照組相比軟骨受損程度明顯減低，但單次注射組與對照組相比無明顯差別。且關節內給藥后，血液中總rhFGF18水平極低，這表明rhFGF18對全身的潛在影響很小。Dahlberg等[14]首次將Sprifermin應用于臨床試驗，Sprifermin治療的病人沒有出現嚴重的安全問題，但還需要更廣泛的研究來證實。Lohmander等[15]對192位有癥狀的骨關節炎患者做了臨床試驗，結果顯示股骨脛骨中間室的關節軟骨厚度與安慰劑組相比沒有明顯改變，但Sprifermin能劑量性依賴地降低股骨脛骨側面處軟骨厚度和體積以及關節間隙寬度的減少。Eckstein等[16]的臨床試驗結果顯示Sprifermin不僅能降低關節軟骨的磨損，還能增加關節軟骨的厚度。

4.2 手術損傷治療

在軟骨損傷修復的其他方面，FGF18也起著非常重要的作用。研究者對母羊施行微骨折手術，術后關節內注射rhFGF18治療的山羊組織填充百分比和O’Driscol評分有明顯改善，軟骨樣組織增多。IHC染色結果顯示，Col2的修復組織染色比Col1a1更強，這表明關節內已經產生了成熟的透明軟骨修復組織[17-18]，且關節內和膜內注射無明顯差異，這表明Sprifermin在注射后可能通過膠原膜運輸以促進微骨折治療軟骨缺損的愈合。另有研究，在幼牛膝蓋軟骨中央區域制造了一個3mm的損傷，并在Sprifermin中培養后發現其膠原含量增加、核心軟骨與環狀軟骨的接觸面積增大[19]。這些結果說明FGF18對關節軟骨損傷的修復起著積極促進的作用。但最近也有研究認為FGF18對軟骨損傷后的合成代謝起負作用。但也有研究發現，未受損傷的人軟骨外植體在FGF18處理后，軟骨代謝相關基因的表達增加，而ACAN和COL2A1的表達降低。受損的人軟骨外植體在FGF18處理后，創傷誘導的MMP2、COL1A1、ACAN、COL2A1的表達都被明顯抑制[20]。兩組研究者者的結果為什么存在差異值得進一步探討。

5 展 望

隨著人們對FGF18的結構、性質的日益明確，研究認為FGF18能對骨和軟骨發育起到正向調節的作用，這可能為骨關節炎的治療提供了新的契機，但其作用機制還需要進一步研究。