T細胞DNA甲基化在部分皮膚病中的研究進展

吳明順 周伏圣 張學軍

表觀遺傳學是指DNA序列不發生改變的情況下，可調控基因表達的一種可遺傳的改變，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等。研究表明，表觀遺傳學與多種疾病的發生發展密切相關，也是常見皮膚病免疫調節的重要機制之一[1,2]。DNA甲基化是表觀遺傳學研究的重要內容，本文介紹T細胞DNA甲基化與免疫相關性皮膚病發病機制的相關性研究。

1 DNA甲基化

DNA甲基化是生物體調節基因表達的表觀遺傳修飾方式之一[3]，其主要存在方式包括:5-胞嘧啶甲基化(5-mC)，5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)和5-胞嘧啶甲酰(5-formylcytosine，5-fC)。人類中最廣泛存在的表觀遺傳修飾是胞嘧啶甲基化[4]。近期研究表明越來越多的人類疾病與DNA甲基化有關[6]，如腫瘤、2型糖尿病、癡呆等[6-8]。其中人類初級細胞和癌細胞的比較也發現了多個差異性甲基化區域， DNA甲基化在胚胎發育、轉錄、染色質結構、X染色體失活、基因印記和染色體穩定性方面具有重要的調控作用，特別是最近對哺乳動物基因組多個序列CpG甲基化分布分析發現DNA甲基化和去甲基化維持在生殖細胞和早期胚胎中的新模式，這將進一步解釋哺乳動物基因組甲基化模式維持的新機制[9-11]。研究還發現DNA甲基化狀態的轉變通常與基因組標記相關，包括轉錄起始位點和內含子-外顯子連接處，而甲基化連同特定的組蛋白標記富集在外顯子區域表明染色質狀態可預示成熟mRNA的含量[10,12]。隨著表觀遺傳學研究的不斷進展，利用甲基化芯片技術測序、甲基化免疫共沉淀測序和BS(Bisulfite Sequencing)等方法可以進一步發現及驗證人類疾病基因組中DNA甲基化位點差異，這將為早期疾病進展預測及與表達遺傳調控關聯研究提供了有利的平臺。

2 皮膚病與T細胞DNA甲基化

皮膚是人體與外界接觸的最重要的屏障組織，不斷受到各種外來因素的攻擊，皮膚組織的免疫調節機制是抵抗外界入侵的重要方式。研究表明與常見的免疫相關性皮膚病相關的T細胞包括細胞毒T細胞(CD8+T細胞)、CD4+T細胞(Th1、Th2、Th22、Th17、Th9、Tfh和Treg細胞)[13-15]，他們通過多種方式(如甲基化修飾、細胞因子活化、基因通路異常)參與疾病相關的免疫炎癥反應[16-21]。而其中T細胞DNA甲基化在免疫性皮膚病中的調控作用是從基因水平上進行深入研究的，這將有利于從遺傳角度來對疾病進行多因素評估。以下主要針對常見的幾種皮膚性疾病T細胞DNA甲基化予以綜述[15]。

2.1 銀屑病與T細胞DNA甲基化 銀屑病是炎性T細胞介導的免疫相關性皮膚病，累及世界人口的2%～3%，美國和加拿大中患病率較高(分別為4.6%～4.7%)，而在非洲、亞洲人群中則為0.4%～0.7%[22,23]。近幾年對銀屑病DNA甲基化表達遺傳調控的研究越來越廣泛。2013年國內的陸前進團隊利用免疫共沉淀測序技術進行全基因組測序，發現了多個差異性甲基化區域，其中高甲基化驗證基因PDCD5和TIMP2低表達，而后張學軍團隊又發現了9個新的差異性甲基化位點，其基因CYP2S1、ECE1、 EIF2C2、MAN1C1、和 DLGAP4表達與甲基化成負相關，該團隊同時利用全基因甲基化數據發現了DNA甲基化可以控制基因遺傳變異[26-28]。而對于免疫性CD4+T細胞在初始CD4+T細胞的極化期間，其DNA甲基化在基因轉錄調節中也起著重要作用[29,30]。2012年，Han等[31]研究銀屑病患者初始CD4+T細胞全基因組DNA甲基化，發現與正常對照組相比，銀屑病患者初始CD4+T細胞在10個不同染色體基因組范圍大小從10到70 kb的26個區域里表現出明顯的低甲基化，而在X染色體上121個基因(包括SLITRK4、EMD、ZIC3、CXorf40A、HDAC6、IKBK等)的啟動子區域表現出顯著性的高甲基化水平。這些變化意味著初始CD4+T細胞可能易于在遇到抗原之前誘發銀屑病，這可能跟不同的環境因素有關，而銀屑病受環境因素影響從而引起DNA甲基化變化。之后Park等[32]發現銀屑病患者CD4+T細胞甲基化值偏高，特別是在啟動子區域，同時從該啟動子區域高甲基化基因中挑選表達水平降低的基因(PPAPDC3、TP73、FANK1和CATSPER2)進行抑制劑-5-氮雜胞苷處理，發現基因表達水平上升。表明銀屑病患者CD4+T細胞DNA甲基化參與調控基因表達，從而參與銀屑病的發病機制。Gervin等[33]分析患銀屑病的同卵雙生子在CD4+T和CD8+T細胞水平上DNA甲基化和基因表達水平差異性并作比較。對患病雙生子和未患病雙生子CD4+T細胞和CD8+T細胞DNA甲基化和基因表達綜合分析發現，DNA甲基化差異與基因表達差異具有顯著相關性的基因(如LDHC、IL13、TNFSF11、MGC3207、CSF2、GIMAP5、GIMAP1、PTHLH、ALOX5AP)，這其中與銀屑病相關的基因(IL13、TNFSF11、PTHLH、ALOX5AP )富集于CD4+T細胞中。該基因DNA甲基化在調節細胞因子級聯反應和參與銀屑病信號通路方面也非常重要。研究還發現與正常對照相比，銀屑病患者FOXP3 Treg特異性去甲基化區域高度甲基化，這種FOXP3是調節性T細胞發育的關鍵調控因子，它的表達與調節性T細胞水平呈正相關[34]。以上研究均表明銀屑病患者T細胞甲基化可能通過調控基因表達從而影響銀屑病的發生發展。

2.2 系統性紅斑狼瘡與T細胞DNA甲基化 SLE是一種累及多個器官系統的復發性自身免疫性疾病，其中自身反應性T細胞在SLE的發病機制中發揮著重要作用[35]。2013年，Coit等[36]研究了SLE患者和健康對照初始CD4+T細胞甲基化水平差異，結果在SLE患者初始CD4+T細胞中發現了47個特異性基因中的86個差異性甲基化位點，其中大多數處于低甲基化。研究又發現在這些低甲基化位點中富集了一些干擾素調控基因，包括IFIT1、IFIT3、MX1、STAT1、IFI44L、USP18、TRIM22 和 BST2，而這些低甲基化干擾素調控基因卻與疾病活動無關。此外，存在于SLE疾病活動期和靜止期的干擾素相關變化表明了表觀遺傳介導的干擾素變化引發的超敏反應持續時間要超過疾病的急性期，而這些初始T細胞中的干擾素引發的超敏反應則表明SLE患者表觀遺傳學狀態存在于祖細胞群體中[37]。后來的研究發現與SLE疾病活動性負相關的甲基化位點富集于染色體Chr3、Chr17、Chr1，該位點也富含轉錄因子BATF、FOS、CEBPB、JUN和STAT3；而與疾病活動正相關的位點則富集于含抑制性轉錄因子EZH2和SUZ12的X染色體上。其中關鍵性轉錄因子EZH2在活動性SLE患者CD4+T細胞表觀遺傳構象變化方面起著關鍵作用[38]。研究初始T細胞甲基化是為了更好的發現與狼瘡發病機制密切相關的T細胞表觀遺傳學變化，從而使導致疾病的環境影響因素和成熟T細胞刺激影響最小化[39]。Zhao等[40]采用hMeDIP-Chip研究5-hmC在特定的基因組位點的表達水平，發現具有高水平5-hmC的2748個基因存在于SLE CD4+T細胞啟動子區域，而這些基因明顯富集在神經營養因子、WNT、MAPK、鈣和mTOR信號通路中。這表明啟動子區域中高DNA羥甲基化可能在SLE致病機制中非常重要。研究還發現與正常對照組相比，狼瘡患者CD4+T細胞中DNA羥甲基化水平顯著增加，可是并沒有發現這種羥甲基化水平與疾病活動性有關，但卻與DNA去甲基化有關；Zhao等[41]研究還發現了與SLE患者不同臨床表型相關的CD4+T細胞特異性DNA甲基化變化，這些變化存在于低甲基化高表達的新型靶向基因NLRP2、CD300LB、S1PR3，以及一些關鍵通路(黏附連接和白細胞跨內皮遷移)。另有研究發現，活動性SLE患者FOXP3 TSDR高度甲基化，并且pSTAT5a表達水平顯著增加，這些都與SLE疾病的活動性直接相關[34,42]。除此之外，研究發現T細胞亞群Th17和調節性T細胞介導的免疫應答在SLE發病機制中也可能發揮著重要的作用[43]。以上表明SLE患者T細胞甲基化或者羥甲基化可能通過影響基因轉錄水平以及基因通路從而影響疾病活動性及進展。

2.3 系統性硬皮病及原發性干燥綜合征與T細胞DNA甲基化 SSc及pSS都是病因及機制不明的涉及多因素的自身免疫性結締組織病，而T細胞在該類病發生、發展過程中起關鍵性作用，其中T細胞甲基化尤為重要。Lei等[44]研究了SSc患者CD4+T細胞整體基因組甲基化狀態及其相關基因調控表達，發現與正常對照組相比，SSc患者CD4+T細胞中全基因組DNA低甲基化，并且DNMT1、MBD4及MBD3基因所表達的mRNA水平明顯下調。而存在于該細胞的TNFSF7(CD70)基因啟動子區域的低甲基化與該基因的高表達水平呈負相關[45]。研究還發現SSc患者CD4+T細胞中的FOXP3基因表達水平降低，該基因調節序列的高甲基化與SSc患者的FOXP3 mRNA表達水平也呈負相關性[46]。這種基因甲基化狀態抑制表達可能導致基因通路的異常活化，進而影響疾病免疫穩態。另有研究結果表明女性患者CD4+T細胞表面CD40L高表達，其DNA調節序列低甲基化，二者負關聯，但這種差異在男性中卻不存在[47]。對于pSS，Yin等[48]研究了pSS患者CD4+T細胞中易感基因甲基化表達水平及調節序列甲基化狀態，研究發現與正常對照組相比，pSS患者CD4+T細胞CD70基因啟動子低甲基化，其mRNA表達水平顯著增高，其中Perforin基因的mRNA水平也顯著增高。這些研究結果表明了SSc和pSS患者CD4+T細胞甲基化狀態及其相關易感基因過表達可能在二者的疾病進展中發揮重要作用。

3 問題和展望

目前免疫-表觀遺傳學越來越成為國內外研究皮膚病發病機制的重要環節，但對免疫細胞(尤其是免疫性T細胞)甲基化與疑難性皮膚病如銀屑病、SLE、SSc、pSS的關系認識還不夠廣泛和深入。由于免疫性T細胞是淋巴細胞中數量最多、功能最復雜的一類細胞，而DNA甲基化又是一個由多種酶促反應參與的重要的表觀遺傳學分子機制，DNA甲基化對基因表達起著重要的調節作用，廣泛研究T細胞甲基化可更深入了解皮膚病相關疾病的發生、發展機制、為藥物靶向作用和臨床應用奠定堅實基礎，DNA甲基化和DNA羥甲基化在疾病機制方面的研究貢獻也值得進一步推進。