揚州市結核分枝桿菌利福平耐藥基因突變分析

戴潔 曾方林 王金富（通訊作者）,2

（1 揚州市第三人民醫院 江蘇 揚州 225025）

（2 揚州大學人獸共患病學重點實驗室 江蘇 揚州 225002）

利福平（RFP)是從利福霉素B得到的一種半合成抗生素，能抑制細菌DNA轉錄合成RNA，達到殺菌作用。絕大多數的RFP耐藥相關基因是rpoB（RNA聚合酶 β亞基），rpoB基因的突變會引起RFP與細菌RNA聚合酶的親和力降低，導致細菌對RFP耐藥[1]。rpoB基因的突變主要是密碼子507到533（RNA聚合酶（rpoB)β-亞單位的81-by）熱點區域。514位和533位密碼子突變是引起低水平耐藥的常見突變位點。D516V，H526Y， H526D，S531L，這4個位點的突變是引起高水平耐藥的常見突變[2]。某些密碼子突變引起的rpoB基因突變并不會導致細菌對RFP耐藥。本研究利用基因芯片技術對揚州地區結核分枝桿菌RFP耐藥基因突變位點特征進行了分析，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2017年經傳統固體培養，并經鑒定為結核分枝桿菌的菌株共346例。

1.2 儀器與試劑

儀器：基因芯片儀器、試劑由北京博奧生物有限公司提供；固體培養和藥敏試劑由珠海貝索生物有限公司提供?；蛐酒瑱z測RFP rpoB基因6個位點，共13種突變型：511位CTG→CCG，513位CAA→CCA、CAA→AAA，516位GAC→GTC、GAC→TAC、GAC→GGC，526位CAC→GAC、CAC→TAC、CAC→CTC、CAC→CGC，531位TCG→TTG、TCG→TGG，533位CTG→CCG。

1.3 方法

1.3.1 痰液化處理 將痰標本用4%的氫氧化鈉（NaOH）溶液液化，液化好的上清液用于接種固體培養基和核酸提取。

1.3.2 傳統培養及鑒定 培養嚴格按《結核病實驗室檢測操作規程》的要求進行，采用PNB和TCH進行鑒定，并定期用H37RV進行質控。

1.3.3 核酸提取 煮沸法提取核酸。

1.3.4 基因芯片 核酸進行PCR擴增，產物用雜交緩沖液處理后進行雜交，再用芯片洗干儀進行洗滌和甩干，最后用芯片判別系統進行掃描和結果判讀，并詳細記錄芯片信息判讀結果。

2.結果

346 例結核分枝桿菌中耐利福平例數為58例（16.7%）。 58例利福平耐藥標本中，RFP耐藥相關基因rpoB基因的531（TCG→TTG）突變位點為34例（58.6%），526（CAC→TAC）突變位點為12例（20.7%），526（CAC→CGC）突變位點為5例（8.6%），526（CAC→GAC）突變位點為1例（1.7%），516（GAC→GTC）突變位點為1例（1.7%），516（GAC→TAC）突變位點為1例（1.7%），511（CTG→CCG）突變位點為4例（7.0%）。

3.討論

MTB耐藥性的增加，導致耐藥結核病感染率逐年上升，加大了結核病防治的難度。許多研究表明，耐藥基因突變導致是導致MTB耐藥的主要原因，通過檢測相關耐藥基因是否發生突變，從而可推斷該MTB是否發生耐藥?；蛐酒夹g是近些年比較流行的一種基因檢測的分子技術，其通過PCR技術對待測菌的基因片段進行擴增，將擴增片段與芯片雜交，即可得到基因突變位點和突變類型。該法具有快速、高通量、靈敏等特點[3]，近來在MTB耐藥檢測中應用廣泛，我們前期的研究[4]也驗證了基因芯片在MTB異煙肼耐藥檢測中具有較好的應用效能。

RFP主要作用于結核分枝桿菌DNA依賴的RNA聚合酶的β亞單位，干擾轉錄的開始及RNA延伸，發揮抑菌和殺菌作用。絕大多數MTB對RFP產生耐藥是由于rpoB基因507-533位發生了突變。rpoB基因507-533位區域稱為利福平耐藥決定區（RRDR），約85%的耐藥菌株出現531位Ser位點、526位His和516位Asp的變異。本次實驗采用博奧公司生產的結核分枝桿菌耐藥試劑盒檢測rpoB基因RRDR的531、526、516、511、533位密碼子，結果顯示揚州地區531、526突變位點為優勢突變位點，其中531位占58.6%，526位占31.0%，最常見突變位點為531（TCG→TTG）突變位點（58.6%）和526（CAC→TAC）突變位點（20.7%），與相關文獻結果相似[5，6]。

另外據相關報道最近在RFP 耐藥菌株中發現了兩個新的rpo B突變（Ser531Gly和 Asp516Thr），以及一個不屬于rpo B基因的突變位點（Ile572Phe）[7]。然而博奧結核分枝桿菌耐藥檢測試劑無法包含上述所有突變基因和突變形式，在檢測的結果中，有可能出RFP實際上耐藥而結果敏感的情況，因此該方法檢測的RFP敏感只能作為參考，并不能明確診斷，是該方法的缺點。