產腸毒素大腸桿菌致使仔豬腹瀉致病機理的研究進展

任敏敏1，徐 娥1，申露露1，王 珍3，項 云4，肖英平2

(1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.浙江農業科學院農產品質量標準研究所；3.綠城農科檢測技術有限公司； 4.金華市農業科學研究院畜牧所)

1 仔豬腹瀉概述

仔豬因腸道內尚未建立穩定的微生態系統，自身抵抗力較低，對外界刺激敏感，易受各種病原微生物的侵襲和各種應激因素的影響。引起仔豬腹瀉的傳染性因素主要是指傳染性病原，有病毒性和細菌性。而細菌性腹瀉主要是由大腸桿菌引起，可引起仔豬黃痢(又稱早發性大腸桿菌病)、白痢(又稱遲發性大腸桿菌病)[2]。仔豬黃痢是初生仔豬的急性、致死性傳染病，主要發生于1周齡內仔豬，以1-3日齡最為常見，發病率(90%)和死亡率(50%)均很高。臨診癥狀以排黃色或黃白色水樣糞便和迅速死亡為特征，病仔豬精神萎頓，糞便呈黃色漿狀、腥臭，嚴重者肛門松弛，排糞失禁，沾污尾、會陰和后腿部，肛門和陰門呈紅色。迅速衰弱，脫水、消瘦、昏迷至死亡。仔豬白痢主要發生于10-30日齡仔豬。發病率高，死亡率低，多發于寒冬、炎熱季節，氣候突變、陰雨潮濕、母豬飼料質量較差、母乳中含脂率過高等常常是本病的重要誘發因素。臨床上以排灰白色漿狀、糊狀腥臭味稀糞為特征。仔豬大腸桿菌病是集約化豬場最常見的疾病之一，能夠引起人或動物體產生腹瀉的最常見的幾種病原型大腸桿菌根據不同的生物學特性可以分為6種類型：彌散粘附性大腸桿菌(disperion adhesion Escherichia coli，DAEC)、腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)、腸侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)、腸聚集性大腸桿菌(enteroaggregative Escherichia coli，EAEC)、腸致病性大腸桿菌(enteropathic Escherichia coli，EPEC)和產腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)[3]。在這些病原型大腸桿菌中，ETEC為最主要的致病菌，是一種重要的能夠在全球范圍內引起疾病的病原，它能夠引起新生仔豬的嚴重腹瀉，給養豬業造成了巨大的經濟損失，且損失日益嚴重[4]。

2 產腸毒素大腸桿菌

研究表明ETEC的主要毒力因子是黏附素(被稱為菌毛的毛發狀結構)、腸毒素(蛋白質或肽類物質)、水腫病毒素、內毒素、溶血素和EatA[5]。ETEC的毒力特性強烈依賴于黏附素(菌毛)和腸毒素的產生[6,7]，ETEC最常見的表面黏附抗原是菌毛(fimbriae)，1990年，人們將其進行分類[8]，大致分為F1(TyI或普通菌毛)、F2和F3(分別是人類ETEC的CFAI和CFAII)，動物ETEC的菌毛為F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)、F17(Fy/Att25)、F41和F18。在動物ETEC細菌中，F4(K88)菌毛至少有三種抗原類型：ab、ac和ad[9]。F18菌毛是一種受質粒調控的菌毛，斷奶仔豬的水腫和腹瀉疾病分別與它的兩種抗原型ab和ac有密切的關系[10-12]。

2.1黏附素 黏附素是存在于細菌表面的某種特定的蛋白質結構或糖脂成分，存在于細菌的細胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛等結構中，能夠使細菌黏附到宿主靶細胞上，對細菌的定植起著重要的作用。黏附素又分為菌毛和非菌毛黏附物質，大腸桿菌的17種黏附素主要存在于腸致病性大腸桿菌、產Vero毒素大腸桿菌(verocytotoxin-producing Escherichia coli，VTEC)和腸出血性大腸桿菌(EHEC)中，少數存在于腸聚集性大腸桿菌(EAEC)和腸產毒素性大腸桿菌(ETEC)中，主要的寄主是人、牛、豬、兔等[13]。

2.1.1F4(K88)菌毛 F4ac是F4(K88)菌毛的三種病原型F4ab、F4ac和F4ad中最常見的一種類型[7]，且目前在世界范圍內均是如此。其中“a”抗原區域相對保守，但是另一個抗原區域是可變的，因此研究者們將其分別定義為“b”、“c”和“d”。F4ab曾經是最常見的一種抗原類型，F4ad曾于1973年在歐洲出現過[14]。Choi和Chae等人檢測了腹瀉豬體內44株F4呈陽性的E．coli菌株后發現，有96%的E.coli載有F4ac菌毛基因，僅4%的E.coli載有F4ab菌毛基因[15]。研究者們用PCR的方法研究了從腹瀉的斷奶仔豬體內分離到的237株ETEC，發現0.8%屬于F4ab，1.3%屬于F4ad，而98%屬于F4ac[16]。所有F4菌毛均能夠將脂多糖和腸上皮細胞的糖綴合物相結合，并且還能夠和腸道黏液及紅細胞結合[17,18]。這三種菌毛的差別表現在抗原類型以及和腸上皮細胞結合特異性上。這是由于某些豬對這三種抗原類型均易感；有些對兩種抗原易感(ab和ac，或ab和ad)；有些僅對一種抗原易感(ad或ab)；有些則對三種抗原均具有抗性[19]。

2.1.2F18菌毛 相較于F4(K88)、F5(K99)和F6(987P)，F18菌毛是一種發現較晚的菌毛，是一種1-2 μm長的柔軟細絲狀，像頭發一樣覆蓋在菌體表面。F18菌毛具有特征性的鋸齒形，并出現在F18ab和F18ac兩種抗原中，其中F18ac在體外更容易表達[16]。F18 ETEC菌株通常能夠產生耐熱腸毒素(heat-stable enterotoxins)，而較少產生不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin，LT)[20]。

2.2腸毒素 大腸桿菌的致病性，并不是由于細菌本身對細胞的致病性引起的，而是由于細菌在體內大量繁殖產生大量的毒素[21]。如腸毒素，主要包括不耐熱腸毒LT(heat-labile enterotoxin)以及耐熱腸毒ST(heat-stable enterotoxin)兩種，其中耐熱腸毒又可分為耐熱腸毒STa(heat-stable enterotoxin a)和耐熱腸毒STb(heat-stable enterotoxin b)。

LT是一種88 kDa的蛋白質，它由一個A亞單位和五個B亞單位組成，5個完全相同的B亞單位形成環狀五聚體，A亞單位位于中央[22]。LT對熱敏感，60℃加熱30 min即被破壞。不能透析，也不易分離，有抗原性。LT根據其抗原性可分LT-I和LT-Ⅱ，LT-Ⅱ不具備腸毒素活性，并且不會引起動物的疾病，LT-I和LT-Ⅱ的主要差別在于它們的B亞單位不同[23-24]。LT分子是由一個約28 ku的酶活性A亞基(LTA)和5個約11.5 ku的B亞基(LTB)組成，LTA和LTB具有不同的功能。LTA是毒素的毒力活性中心，它能催化細胞中與調控腺苷酸環化酶有關的一種膜蛋白腺苷二磷酸核糖基化，激活靶細胞cAMP，使cAMP 含量升高；LTB是毒素的免疫原性中心，可與靶細胞上的特異性受體GM1結合，介導LTA的進入，以產生毒素活性[25]。目前對LT的功能進行研究的有很多，如Horstman等人研究結果提示，由于LT在細菌表面和脂多糖(LPS)相結合，因此LT可能作為一種黏附素將細菌和腸上皮細胞表面的GM1神經節苷脂相結合[26]。此外Berberov等人的研究發現，將編碼LT蛋白的基因敲除后，不但能使動物腹瀉的程度減輕，而且減少了細菌向無菌豬腸道的定植[27]。這些發現則提示LT可能起著黏附素的作用。

耐熱腸毒素STa，是一種小分子量蛋白(約2 KDa)，由18或19個氨基酸構成，具有3個鏈內二硫鍵；STa可溶于水和甲醇，在100 ℃加熱30 min或121 ℃加熱15 min仍可保持生物活性；耐多種有機溶劑和表面活性劑：抗各種蛋白酶水解，為肽類毒素中最特殊者[28]。

耐熱腸毒素STb，是一種由48個氨基酸組成的蛋白質，分子量約為5 kDa；成熟的STb具有四個半胱氨酸殘基，可形成兩個分子內二硫鍵；STb對熱穩定，100 ℃加熱30 min仍可保持生物活性；與STa不同，STb對蛋白酶等比較敏感，經胰蛋白酶或β-巰基乙醇處理后便會失去生物活性[29]。

3 ETEC的致病機理

3.1粘附素的定植過程 菌毛粘附素有助于ET EC附著在小腸黏膜上皮細胞及結膜層上。 ETEC通過消化道進入動物腸道后，不斷繁殖，當細菌在小腸中達到一定的數量后，能夠和小腸上皮的受體結合并黏附在上皮細胞上，或者利用特殊的菌毛黏附素，而黏附并覆蓋于上皮細胞的黏液上。ETEC由纖毛抗原介導的粘附作用，使其能牢固地粘附在小腸粘膜上，避免被分泌的粘液、小腸蠕動、小腸絨毛的運動等所清除。

大腸桿菌對腸道細胞的粘著分兩步：(1)粘著和定植：首先，菌毛粘附素結合在豬小腸上皮細胞刷狀緣的受體上。大腸桿菌的菌毛頂部和周圍布滿了受體結合位點。受體的碳水化合物部分決定菌毛粘附素的特異性。在菌毛粘附素較為松散地結合于受體上以后，信號轉導引發宿主細胞的蛋白磷酸化，同時細胞間 Ca2+升高，并發生肌醇三磷酸化，使細菌與受體以一種高特異性的方式相互結合，隨后定植在腸道內繁殖。而無菌毛的菌體僅形成一種松散而短暫的結合，不產生毒素。ETEC定植的程度決定了動物的腹瀉是否是由細菌感染引起的。能夠產生F5、F6和F18型菌毛的ETEC大多定植在空腸和回腸的末端，F4+ETEC通常可以定植在整段空腸和回腸。F4菌毛可介導ETEC向各個年齡段的大部分豬的小腸內定植。因此，F4+ETEC向腸黏膜的定植可以發生在新生和斷奶仔豬體內，并且還可能發生在育肥豬體內。并且由F4菌毛介導的黏附是ETEC種特異性的，大多發生在豬體內[28]。(2)促進細菌繁殖和毒素的產生：大腸桿菌一旦粘附在粘膜細胞，就開始大量繁殖。細菌在生長過程中，產生大量的毒素不斷釋放到腸道內。

3.2腸毒素導致腹瀉的機理 ETEC的兩種腸毒素進人腸道后，首先與腸壁上皮細胞受體GM1結合。LT與神經節苷酯GM1結合后激活腸上皮細胞的腺苷酸環化酶，使細胞質中的cAMP含量持續增加；ST與GM1結合后，激活腸上皮細胞的鳥苷酸環化酶，促使細胞漿中cGMP的水平上升，且兩種腸毒素致病機理有異[30]。

LT的致病機理：單獨的亞單位沒有生物學活性，只有結合在一起才具有全毒素的生物學和化學特性。經典的LT致病機理為：首先B亞單位與上皮細胞膜GM1受體緊密結合，通過胞飲作用進入細胞，并經過內質網被轉運。其具有ADP-核糖基化轉移酶活性的A 亞單位從NAD上把一個ADP-核酸基團轉移到GTP捆綁蛋白的a亞基上，激活細胞基底膜上的腺苷酸環化酶，從而引起細胞內cAMP 濃度升高，cAMP依賴性蛋白激酶被激活，造成上皮細胞膜氯離子通道的超常磷酸化及離子通道囊性纖維變性損傷，最終使上皮細胞分泌氯離子亢奮和絨毛頂端吸收NaCl受到抑制而引起分泌性腹瀉[31]。近年來的研究還提出了一些新的LT致病機制，如LT可能通過促進花生四烯酸代謝產物的合成和釋放，刺激腸道神經系統及激發腸道炎癥反應等影響腸上皮細胞的分泌。

STa的致病機理：STa的激活作用具有專一性，這是由于STa對小腸粘膜顆粒性酶比可溶性酶具有更高的親和力，同時小腸粘膜本身以顆粒性酶為主。研究發現，STa能夠激活鳥苷酸環化酶(guanylate cyclase)系統，進而導致細胞內cGMP增多[32]。有關STa激活酶的作用機理主要有兩種學說[33]：一是“瀑布”學說，認為STa結合到細胞膜表面，打開鈣離子通道，鈣攝取增加，激活調鈣蛋白，觸發磷酸脂酶A，膜磷脂釋放花生四烯酸, 后者的過氧化物及過氧化氫代謝物使鳥苷酸環化酶激活。但也有的學者認為，STa并不引起小腸細胞花生四烯酸的釋放及改變膜脂成分。二是“直接偶聯”學說，該學說認為STa激活鳥苷酸環化酶是直接的，不需要介導酶，即與已知腺苷酸環化酶激活機理相似，依靠ST受體復合物系統激活。 S.A.Waldman進行研究發現了小腸粘膜顆粒性鳥苷酸環化酶與ST受體偶聯的新模式，即兩者可能通過細胞骨架成分緊密相連。這種偶聯可抵抗各種離子、非離子去垢劑、鹽及尿素等的溶解，而其他組織上的酶可被上述物質所溶解，但ST受體抵抗溶解作用，說明其他組織中酶與受體無特殊偶聯關系。進一步研究發現, 位于刷狀緣的25 kD蛋白磷酸化后，在小腸可介導STa毒素誘導的離子轉移[34]。推測ST的作用可能與霍亂腸毒素通過cAMP升高使Na泵磷酸化、Na 吸收障礙導致水瀉的機理相似[30]，即cGMP使Cl-轉運蛋白磷酸化，CI-主動轉運受抑制，進而腸腔內電解質與水儲留引起腹瀉，使水、鈉離子、碳酸根離子大量喪失，造成脫水、代謝性酸中毒、高血鉀癥，使心力衰竭，有部分病例還會急性死亡。

STb的致病作用：STb的作用機理尚不清楚，它不能激活鳥苷酸環化酶和腺甘酸環化酶，也不能利用環化酶激活旁路，但有研究認為STb在被胞飲之前是非特異性地結合到靶細胞膜上的[35]，STb會引起細胞內Ca2+濃度升高，但對cAMP或cGMP的濃度并沒影響[36]。

4 展望

ETEC的毒力因子多而復雜，抗原性也不同， ETEC的研究方向是進一步從分子角度闡明其致病機理，明確毒力因子產生與致病性的關系，深入對各個毒力因子基因的研究，以期制定出更為有效的預防和防疫措施。