炎癥及細胞自噬與急性肺損傷關系的研究進展①

孫 健 沈巨信

(紹興市人民醫院呼吸內科，紹興312000)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是由各種肺內、外致病因素導致的急性、彌漫性炎癥性肺損傷，進而引起急性呼吸衰竭的臨床綜合征[1]。ALI是常見的呼吸危重癥之一，在重癥監護病房，其病死率高達40%～50%[2,3]。ALI病因復雜，確切的發病機制未明。但目前認為，肺內炎癥細胞的過度活化、募集，失控性地釋放炎性因子，是急性肺損傷的根本原因，而不依賴其特定的病因[1]。多種炎癥細胞因子參與了ALI發生和發展，其中，IL-1β與TNF-α是兩個關鍵的細胞因子，由于其具有進一步觸發其他促炎細胞因子分泌的作用，故又被稱為“早期反應細胞因子”。研究顯示，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3)炎性體(NLRP3 inflammasome)是調控IL-1β成熟和分泌的關鍵分子結構。新近研究還發現自噬能抑制炎性體及其關鍵效應蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)的活化，減少IL-1β等炎癥因子的釋放。由此提示，針對NLRP3炎性體及自噬的治療有可能成為防治ALI的靶點之一。本文就炎癥與自噬對ALI作用的研究進展做一綜述。

1 炎癥與急性肺損傷

1.1炎性與天然免疫 炎癥反應是機體遭受創傷、感染等外源性及內源性刺激后的一種防御性反應,可通過激活天然免疫和獲得性免疫應答恢復機體的動態平衡[4]。天然免疫是機體防御病原體的第一道防線，主要通過模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRRs)來感受并識別各種內外刺激信息[5]。PRRs可識別病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及損傷相關分子模式(Damage-associated molecular patterns，DAMPs)，并向下游傳遞信號，引發一系列的免疫應答，從而對入侵的病原體或損傷等危險信號做出快速的反應，清除各種損害因素并修復機體損傷[6,7]。

根據PRRs存在的部位，可分為膜結合PRRs和胞內PRRs。膜結合PRRs主要包括Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)；胞內PRRs主要包括核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NOD-like receptors，NLRs)和維A酸誘導基因Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)等。

TLRs是一類在天然免疫中起關鍵作用的膜結合PRRs。目前已發現并成功鑒定13種TLRs家族成員，不同的TLRs可以識別不同的病原刺激分子，TLR1～5主要位于細胞膜表面，可識別細菌及真菌成分，TLR3和TLR7～13則大多數位于內體或內體溶酶體，主要識別病毒及微生物核酸及內源性刺激分子[8]。當TLRs識別PAMPs/DAMPs后，可通過激活核因子kappaB (NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和c-jun N末端激酶(JNK)等信號通路，啟動核轉錄和翻譯功能，誘導產生各種促炎細胞因子及趨化因子而產生炎癥[9]。研究證實，革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)與單核/巨噬細胞表面TLR4結合，通過修飾NF-κB、MAPK磷酸化水平而上調TNF-α、IL-8等細胞因子的表達，而抑制細胞NF-κB或MAPKs磷酸化水平可抑制細胞因子的釋放[10]。近年來，大量體內及體外的研究也證實，抑制NF-κB或MAPKs等信號轉導通路能夠有效抑制炎癥細胞因子的釋放并減輕急性肺損傷[11-15]。

1.2細胞因子與IL-1家族 細胞因子是一類小分子蛋白質(分子量8～40 kD)，由免疫細胞、內皮細胞以及成纖維細胞等多種細胞產生，在細胞信號轉導中起重要作用。其通過受體作用調節機體免疫應答，在介導感染、炎癥、創傷、癌癥和生殖的反應中起了重要的作用。細胞因子按其功能可分為促炎細胞因子及抗炎細胞因子。研究顯示，適當分泌的細胞因子可通過旁分泌作用激活巨噬細胞或中性粒細胞產生局部抗炎作用，同時募集中性粒細胞到炎癥部位并殺滅病原體[16]。然而，當細胞因子大量釋放時，一方面激活內皮細胞，增加血管通透性使得免疫細胞滲出到炎癥部位吞噬并殺滅病原體；但另一方面，也增加了毛細血管滲漏及血管擴張，導致了低血壓等一系列有害的全身效應[4]。 在所有的細胞因子中，IL-1家族與天然免疫最密切相關，因為IL-1受體Ⅰ(IL-1RⅠ)的胞漿區與所有TLRs胞漿區都高度同源[17]。IL-1R與TLRs一起形成受體超家族，該家族的幾乎所有成員的胞漿區均具有共同的功能域，也稱之為Toll-IL-1R(TIR)結構域，因此，各種炎癥刺激都可不加區分地同時激活TLR和IL-1R并激活下游信號通路，進而引發一系列炎癥應答[18]。目前已發現10個IL-1家族成員，其中IL-1β因與自身免疫密切相關，故而也是IL-1家族中研究最多的成員之一。早期研究顯示，重組IL-1β對中性粒細胞缺失小鼠抵抗致死性細菌感染具有重要的保護作用，提示恰當的細胞因子及炎癥反應是保護機體并抵抗外源性刺激的屏障。但進一步研究發現，過度分泌的細胞因子，卻常常成為各種急慢性炎癥的病因。幾乎所有的病原微生物均可通過TLRs誘導產生IL-1β，IL-1β以無活性的前體形式pro-IL-1β分泌并聚積在胞漿中，成熟IL-1β的生成是通過炎性體的活性成分caspase-1介導的，當炎性體被激活后，可募集并產生活性caspase-1，通過剪切作用產生活性IL-1β而進一步發揮生物學效應[19]。

1.3細胞因子風暴與急性肺損傷 感染、創傷、燒傷、大面積肺栓塞、大量輸血和休克等多種病因均可引起ALI。但近年來大量研究表明，各種不同因素引發的全身炎癥反應綜合征是ALI發生的根本原因[1]。肺內外有害刺激可引發多種炎癥細胞在肺內的募集和活化，釋放大量細胞因子及趨化因子。其中，IL-1β與TNF-α在受到有害刺激早期即迅速分泌，數小時即達峰值，隨后，機體開始分泌抗炎細胞因子調節炎癥反應程度，使機體既能清除有害刺激，又能維持細胞穩態。但當有害刺激持久強烈或機體免疫亢進時，促炎抗炎平衡被打破，則這類“早期反應細胞因子”可進一步促進如IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、巨噬細胞炎癥蛋白1α(Macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α)、MIP-1β等一系列細胞因子及趨化因子的活化及釋放，引起級聯“瀑布效應”，從而形成一種失控的炎癥反應，這一過程也被稱為“細胞因子風暴”。

“細胞因子風暴”最早被用于描述移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)[20]，其本質是機體對于各種刺激所產生的一種過度免疫。細胞因子風暴與多種感染或非感染性疾病相關，甚至是不恰當治療干預的結果[21]。近年來一些實驗研究及臨床研究中也發現，導致ALI的原因往往并非病原體本身，而是感染誘發了機體產生過度的免疫應答[22，23]。細胞因子風暴導致了廣泛的肺上皮細胞和肺血管內皮細胞的損傷，最終引起ALI的病理改變，即肺血管通透性增高、肺水腫及透明膜的形成。由此提示，細胞因子風暴可能是ALI的根本發病原因[24]。

2 NLRP3炎性體與急性肺損傷

2.1NLRP3炎性體結構與功能 NLRP3炎癥體是胞漿中的大分子蛋白質，屬于NLRs家族,是一類胞內PRRs，在多種免疫細胞中廣泛表達，是目前功能研究最明確的炎性體，主要包括NLRP3構架、銜接蛋白凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)以及caspase-1[25]。NLRP3構架主要包含3部分：中間的核苷酸寡聚化結構域(Nucleotide-binding and oligomerization,NACHT)，C末端的亮氨酸重復序列(Leucine-rich repeats，LRR)，以及N端的效應結構域。當NLRP3識別PAMPs/DAMPs后，發生自身寡聚化使其效應結構域暴露形成一個“平臺”，并募集銜接蛋白ASC。ASC包含2個結構域，胱天蛋白募集域(Caspase recruitment domain，CARD)和熱蛋白結構域(Pyrin domain，PYD)。ASC被募集后，其PYD能和其他NLRs的同型PYD相互作用，通過CARD招募caspase-1的前體(pro-caspase-1)，并通過自身剪切作用形成成熟的caspase-1。ASC的兩個結構域將NLRs與caspase-1聯系在一起，使各種內源性或外源性刺激信號能夠活化caspase-1[26]。而活化的caspase-1可以剪切pro-IL-1β形成成熟的IL-1β并分泌到胞外[27]。活化的IL-1β一方面可以誘導形成級聯瀑布效應，引起炎癥細胞因子風暴；另一方面可直接破壞肺泡上皮細胞，導致肺泡通透性增加而引發肺水腫。

2.2NLRP3炎性體與急性肺損傷 如前所述，失控的炎癥反應而引發的炎癥介質，在急性肺損傷的形成過程中起了關鍵作用[28]，IL-1β是關鍵的促炎細胞因子，其不僅導致炎癥，更重要的是可以誘導一系列的促炎細胞因子及黏附分子的產生并加重肺部炎癥[29]。Dolinay等[30]研究發現，膿毒癥所致ALI患者血漿中caspase-1及IL-1β、IL-18表達增高，提示NLRP3炎性體激活，且IL-1β水平與患者病情嚴重程度、病死率呈正相關。研究顯示，LPS刺激肺泡巨噬細胞不僅激活NLRP3炎癥體并釋放成熟的IL-1β，而且通過NF-κB依賴的信號途徑上調巨噬細胞表面的IL-1RI的表達，從而導致肺泡巨噬細胞的焦亡(Pyroptosis)并加重肺部炎癥[31]。同時，NLRP3炎性體可以活化肺泡巨噬細胞，加重肺損傷[32]。而抑制肺泡巨噬細胞的焦亡則可以有效減少LPS誘導的ALI[33]。上述研究顯示，NLRP3炎性體通過調控細胞因子的水平，可能在ALI的形成過程中起了重要作用。

3 細胞自噬與急性肺損傷

細胞自噬(Autophagy)是真核生物進化中高度保守的、對細胞內物質進行周轉的重要過程。自噬不僅能滿足細胞自身代謝并維持細胞穩態，而且還是一種機體自身防御和應激調控機制[34]。當細胞處于感染、損傷等各種應激狀況下，細胞自噬啟動，降解受損、變性和失去功能的細胞器和蛋白質，實現細胞的再循環和再利用。細胞自噬參與調節多種重要的生理過程如細胞增殖、分化、炎癥及免疫應答、程序性細胞死亡等[35]。近年來研究顯示，細胞自噬與ALI的發生發展密切相關[36-38]。

3.1自噬調節炎性體活性 自噬與炎癥體均有調節細胞代謝、維持細胞器正常功能、控制炎癥及清除病原的作用，因此均有維持細胞穩態的效能[39]。Saitoh等[40]研究顯示造血細胞自噬蛋白Atg16l1缺陷的小鼠，其IL-1β和IL-18水平上升，提示自噬可以起到調控炎性體活性的作用。Nakahira等[41]研究證實，自噬能清除進入細胞的病原體和機體中老化或受損的細胞器(如去極化的線粒體)，減少了胞內PAMPs/DAMPs積聚，從而間接抑制炎癥體活性，而自噬缺陷小鼠由于炎性小體的活化導致血清IL-1β和IL-18水平明顯增高。Pu等[42]研究顯示，相比于野生型小鼠，Atg7基因敲除的膿毒癥小鼠，因自噬功能受到抑制，NLRP3炎性體介導IL-1β釋放增加，導致嚴重肺損傷引起死亡率增加。但自噬并非只有單純抑制炎癥的作用，如Dupont等[43]研究發現，自噬蛋白組分能促進成熟的IL-1β從胞漿分泌到細胞外而產生促炎作用，顯示截然不同的效應。由此提示，自噬可能有利于機體調控促炎與抗炎的平衡，自噬與炎癥體之間通過復雜的調控網絡，共同維持細胞穩態[44]。

3.2自噬調節ALI 如前所述，細胞自噬是機體對有害刺激的保護性反應。研究顯示，肺上皮細胞暴露于氯氣1 h后出現線粒體功能受損并增加活性氧(ROS)的釋放，而暴露6 h后細胞自噬功能上調并改善細胞功能[45]；動物實驗發現類似效應，如高氧誘導的ALI小鼠模型中發現，其自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3B(Microtubule-associated protein 1 light chain3B-Ⅱ,LC3B-Ⅱ)及自噬體在胞漿內大量積聚，提示細胞自噬明顯增強[46]。由此提示，ALI形成過程誘導并激活了細胞自噬水平。

那么，細胞自噬是否能調節ALI嚴重程度？Joosten等[47]研究顯示，自噬可降解IL-1β前體pro-IL-1β，從而減少成熟IL-1β釋放。Harris等[48]進一步證實，IL-1β的前體pro-IL-1β能特異性地被自噬體靶定并隔離，雷帕霉素能通過抑制雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)誘導細胞自噬，促進pro-IL-1β的降解而減少成熟的細胞因子釋放。Tanaka等[46]研究顯示，自噬相關蛋白LC3B基因敲除小鼠由于自噬缺陷而增加了高氧誘導的肺上皮細胞死亡。Lo等[49]研究還發現，在盲腸結扎穿孔法誘導的多細菌感染膿毒癥小鼠模型中，自噬蛋白LC3過表達能增加細胞自噬功能，并有效地抑制小鼠ALI，增加小鼠存活率。最近，國內Jia等[50]研究顯示，自噬誘導劑雷帕霉素可以通過抑制NLRP3炎性體，下調細胞因子IL-1β和IL-18的產生，并減輕LPS誘導的小鼠ALI。Zhao等[51]也發現，雷帕霉素誘導自噬明顯減少了膿毒癥小鼠血清中細胞因子的釋放，改善ALI的嚴重程度并增加小鼠存活率。但Ding等[52]研究顯示，自噬抑制劑3-甲基嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)抑制自噬卻反而抑制了肺部炎癥，有效地逆轉了LPS誘導的小鼠ALI，顯示完全相反的結果。可見細胞自噬調節機體免疫功能是一個復雜的過程[53]。因此，盡管已經明確自噬參與了ALI的發生發展過程，但進一步明確自噬在不同病程或不同感染狀態下的作用并進行靶向干預，對ALI的治療有著重要的意義。

4 ALI的抗炎治療

由于炎癥及IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子在ALI早期起關鍵作用，使得抗細胞因子的治療被引入臨床，但多項隨機雙盲臨床研究結果顯示[54-56]，抗細胞因子治療，如抗TNF-α單克隆抗體、重組抗IL-1受體拮抗劑(rhIL-1RA)等對膿毒癥ALI患者的療效總體上令人失望，其28 d死亡率并沒有顯著降低[55，56]。血漿IL-1受體拮抗蛋白(IL-1RA)屬于IL-1細胞因子家族的成員，是IL-1β的天然抑制劑。最近一項回顧性研究發現，rhIL-1RA能夠明顯改善血漿IL-1RA高水平患者預后，使該組患者28 d死亡率降低約12%，提示血漿高表達IL-1RA可能對抗炎治療具有更好的應答[57]，這意味著將來有必要對ALI患者進行更精確的個體化治療。而近年來有證據表明，隨著炎癥反應的持續，大量免疫細胞凋亡耗竭，隨后機體進入免疫抑制階段[58]，故此階段抗炎治療可能反而對機體有害，而適當應用增強宿主免疫功能的免疫佐劑反而具有更積極的作用[59]。IL-7是一種多功能的細胞因子，其不僅可增加吞噬細胞的功能，還可誘導記憶性T細胞的有效增殖，有助于恢復膿毒癥患者免疫抑制階段T細胞的嚴重耗竭。最近完成的一項隨機雙盲的臨床試驗(IRIS-7研究，注冊號NCT02640807)表明，經重組人IL-7(CYT107)治療后患者絕對淋巴細胞計數、CD4+、CD8+T細胞計數增加了3～4倍并持續數周，顯示積極的臨床治療前景[60]。

炎癥信號轉導通路在炎癥反應中的關鍵作用同樣受到關注，多項體內及體外實驗研究證實,抑制NF-κB或MAPKs等信號轉導通路能夠有效抑制炎癥細胞因子的釋放[11-13,61,62]。烏司他丁是一種尿胰蛋白酶抑制藥物，其能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減少細胞因子的釋放，對LPS誘導的ALI動物模型有保護作用[63]。最近，我國啟動了一項烏司他丁治療膿毒癥的多中心隨機對照研究(ADJUST研究，注冊號:NCT02647554)，其主要終點為患者28天的死亡率[64]。我們期待其抗炎效應能給膿毒癥ALI患者帶來一線曙光。而盡管多項體內及體外實驗已經顯示調節細胞自噬有利于減少細胞因子釋放并減輕ALI，但目前相關藥物尚未進入臨床研究。

此外，高濃度氧療和機械通氣是目前臨床上搶救ALI最基礎的治療手段。但近年來研究顯示[65]，高氧可誘導小鼠肺內神經酰胺水平升高，進而激活NLRP3炎癥體并誘導caspase-1的活化，導致IL-1β、TNF-α等細胞因子釋放增加產生高氧性ALI。而NLRP3基因缺陷小鼠暴露于高氧環境時，其肺部細胞因子濃度及肺組織病理評分明顯低于野生型小鼠[66]。提示針對NLRP3炎性體靶向治療有望控制高氧性ALI。Wu等[67]研究顯示，機械通氣能激活小鼠肺泡巨噬細胞NLRP3炎性體的活性，增加成熟IL-1β釋放，而中和IL-1β顯著減少肺部炎癥損傷，提示NLRP3炎性體參與了呼吸機相關肺損傷(Ventilation induced lung injury，VILI)的發生發展，不僅如此，VILI還與機械通氣的模式密切相關，事實上，肺保護性通氣已經成為目前急性呼吸窘迫綜合征機械通氣的目標[68]。可見，在臨床救治ALI患者時，還需綜合考慮氧療濃度、時間及機械通氣的模式對患者炎癥及免疫反應的影響。

5 展望

ALI起病迅速，病情兇險，近年來，盡管越來越多的治療方法用于搶救臨床危重癥患者，但針對ALI仍然缺乏有效的救治手段。而膿毒癥相關的ALI仍然是ICU死亡率最高的臨床綜合征。正是由于ALI的發生發展，包括了炎癥、免疫平衡及細胞自噬之間錯綜復雜的關系，因此也增加了疾病救治的難度，但進一步闡明炎癥及自噬與ALI之間的關系，有可能成為一個新的治療ALI靶點。同時，也亟待更多的實驗和臨床研究來進一步加以論證。