基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記研究進(jìn)展

何虎翼， 樊吳靜， 唐洲萍， 楊 鑫， 李麗淑， 譚冠寧， 何新民

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，廣西南寧 530007)

1 植物轉(zhuǎn)座子

植物轉(zhuǎn)座子是廣泛分布于植物基因組中的一類能從染色體的一個(gè)位置跳躍到另一個(gè)位置或者另一條染色體的DNA序列。根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制的不同可分為DNA轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。DNA轉(zhuǎn)座子是一類由DNA介導(dǎo)，通過“剪切-復(fù)制”進(jìn)行轉(zhuǎn)座的可移動元件，包括微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted repeat transposable elements，簡稱MITEs)和Helitron，其插入位點(diǎn)多態(tài)性豐富、拷貝數(shù)多。MITEs兩端由末端反向重復(fù)序列(terminal inverted repeat，簡稱TIR)和靶位點(diǎn)重復(fù)序列(target site duplication，簡稱TSD)組成，富含 T/A，其轉(zhuǎn)座主要依靠自主型DNA轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是一類廣泛分布于植物基因組的由RNA介導(dǎo)，通過“復(fù)制-粘貼”進(jìn)行轉(zhuǎn)座的可移動遺傳因子。根據(jù)是否具有長末端重復(fù)元件(long terminal repeat，簡稱LTR)又可分為LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子包括2種類型——Ty1-copia和Ty3-gypsy，非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子包括長散在核重復(fù)序列(long interspersed nuclear element，簡稱LINE)和短散在核重復(fù)序列(short interspersed nuclear element，簡稱SINE)。植物轉(zhuǎn)座子具有拷貝數(shù)豐富、插入位點(diǎn)多態(tài)性、高度異質(zhì)性等特點(diǎn)，非常適合用來開發(fā)分子標(biāo)記。

2 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記類型

目前基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記技術(shù)主要包括序列特異擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-specific amplification polymorphisms，簡稱S-SAP)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列間擴(kuò)增多態(tài)性(inter-retrotransposon amplified polymorphism，簡稱IRAP)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子-微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性(retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism，簡稱REMAP)、基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入多態(tài)性(retrotransposn-based insertion polymorphisms，簡稱RBIP)。S-SAP標(biāo)記技術(shù)來源于擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)，由限制性內(nèi)切酶Pst1和Mse1消化基因組DNA，通過連接接頭進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，在同一位置片段的有無有判斷其多態(tài)性。不僅可以檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子內(nèi)部變異，還可以用來檢測插入位點(diǎn)的多態(tài)性[1]。IRAP標(biāo)記技術(shù)是利用基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增出相鄰?fù)患易宓姆崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子成員間的片段，從而檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)間的多態(tài)性[2]。REMAP標(biāo)記技術(shù)是利用基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域和微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與相鄰微衛(wèi)星間的片段，從而檢測反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與簡單重復(fù)序列間的多態(tài)性[2]。RBIP標(biāo)記技術(shù)是以PDR1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子設(shè)計(jì)引物，篩選基因組文庫，通過測序獲得該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及兩側(cè)翼的堿基序列，再通過設(shè)計(jì)特異引物組合A/E或C/E產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[3]。這些基于轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記技術(shù)普遍具有共顯性、高多態(tài)性和高重復(fù)性等特征，已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、變異鑒定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面。

3 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記應(yīng)用

3.1 遺傳多樣性分析

基于PDR1的S-SAP標(biāo)記技術(shù)顯示豌豆屬可分為Pisumfulvum、Pisumabyssinicum、Pisumspp.等3組[4]。基于Tps12、Tps19和PDR1的S-SAP標(biāo)記揭示了55份不同豌豆種間和種內(nèi)的關(guān)系[5]。基于Tms1元件的S-SAP標(biāo)記技術(shù)非常適合用來研究紫花苜蓿的遺傳多樣性[6]。基于BARE-1、BAGY-1、BAGY-2、Sabrina、Nikita、Sukkula等6個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族的S-SAP分子標(biāo)記可以用來比較大麥的遺傳多樣性[7]。基于Vine-1的S-SAP擴(kuò)增能有效分析葡萄的遺傳多樣性[8]。基于Ty1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的S-SAP標(biāo)記技術(shù)可用于檢測不同生態(tài)型黃瓜材料間的多態(tài)性[9]。利用不同酶切組合S-SAP引物建立了適用于糯玉米的DNA圖譜[10]。利用10個(gè)S-SAP引物組對28份柿屬基因型種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)MseI與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子引物組擴(kuò)增性能最優(yōu)[11]。基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的25對S-SAP引物將28份柿屬植物聚為2組[12]。利用S-SAP標(biāo)記技術(shù)檢測短芒大麥突變系種群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)種群遺傳變異主要存在于種群內(nèi)[13]。利用基于楊梅Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列設(shè)計(jì)的18個(gè)S-SAP引物將48份楊梅試材分為3個(gè)組，分組結(jié)果與地域來源基本一致[14]。

基于2個(gè)不同類copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)將克萊門柚分成北非和西班牙2組，分組結(jié)果與地理來源基本一致[15]。利用基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子IRAP標(biāo)記技術(shù)可以將59份烤煙品種分為14個(gè)類群[16]。為分析茄子遺傳多樣性，根據(jù)馬鈴薯和煙草反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域設(shè)計(jì)引物并建立了茄子IRAP分子標(biāo)記體系[17]。用基于馬鈴薯和煙草反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的2組引物將34份茄子材料分為3大類群[18]。通過優(yōu)化各影響因素，建立了穩(wěn)定的香菇IRAP分子標(biāo)記技術(shù)體系[19]。與ISSR方法相比，用IRAP標(biāo)記分析煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性的品種間遺傳相異系數(shù)和多態(tài)性比率更高[20]。利用基于小麥反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Wis2-1A的IRAP標(biāo)記技術(shù)可將21個(gè)小麥品種聚成6大類群[21]。沈玉英等利用基于梅Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)體系研究了梅的遺傳多樣性和親緣關(guān)系[22]。杜曉云等利用IRAP標(biāo)記技術(shù)揭示了部分柿屬種間倍性進(jìn)化關(guān)系[23]。基于Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)也適用于檢測火龍果IRAP多態(tài)性[24]。利用IRAP標(biāo)記可以區(qū)分36份小麥材料的抗性強(qiáng)弱關(guān)系[25]。李慧等利用IRAP標(biāo)記技術(shù)研究顯示，湖北省建始縣的“關(guān)口葡萄”與歐美雜交雜種親緣關(guān)系最近，其來源可能與“尼加拉”和“白香蕉”有關(guān)[26]。崔博文等利用29條IRAP引物將12份馬尾松種質(zhì)分為3類，并構(gòu)建了DNA指紋圖譜[27]。王燕等利用IRAP標(biāo)記技術(shù)將48份柿屬植物區(qū)分為野生君遷子居群、柿品種和浙江柿種質(zhì)3組[28]。賈春平等基于4個(gè)稻屬反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LTR區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用IRAP標(biāo)記方法分析新疆粳稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性比率為93.4%的Houba/Tos5/Osr13引物最適合于DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，以0.55為閥值將37份新疆粳稻品種(系)分為6大類群[29]。10個(gè)IRAP引物可將49份江西柿屬種質(zhì)資源分為柿、油柿、野柿3種[30]。

沈玉英等利用REMAP標(biāo)記技術(shù)將24個(gè)梅品種聚為3組[31]。通過Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR保守區(qū)域和ISSR設(shè)計(jì)引物，王東等建立了甜瓜屬REMAP分子標(biāo)記技術(shù)體系[32]。為鑒定中國水仙種質(zhì)資源遺傳多樣性，林曉紅等建立了優(yōu)化的REMAP技術(shù)體系[33]。馬忠友等建立了一種基于MITEs的分子標(biāo)記方法，可廣泛應(yīng)用到水稻及其他植物上[34]。利用AhMITE轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)可以鑒定花生栽培種及高世代材料的親緣關(guān)系[35]。基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在遺傳多樣性中的應(yīng)用詳見表1。

表1 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在遺傳多樣性中的應(yīng)用

3.2 變異鑒定

利用S-SAP標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)富士蘋果芽變品種產(chǎn)生可能與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入有關(guān)[36]。利用基于蘋果Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子建立S-SAP標(biāo)記技術(shù)可以區(qū)分元帥蘋果芽變[37]。一個(gè)基于蘋果查爾酮合成酶基因啟動子的特異性片段可以用來鑒定芽變材料發(fā)生的性狀變異[38]。何平等用7對基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的S-SAP標(biāo)記引物將15個(gè)蘋果芽變品種區(qū)分為嘎拉系、元帥系和富士系[39]。基于普通歐柑特異片段的S-SAP標(biāo)記技術(shù)可鑒別青甌柑品種[40]。

基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的單引物IRAP-PCR可以有效建立33份柿屬植物基因型的DNA指紋圖譜，可以區(qū)分芽變品種[41]。基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列開發(fā)的分子標(biāo)記可用來鑒定族毛麥染色質(zhì)，提高小麥-族毛麥易位系的利用價(jià)值[42]。基于蘋果反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物的IRAP標(biāo)記技術(shù)可以鑒定部分芽變品種[43]。通過利用IRAP引物鑒定元帥蘋果和富士蘋果無性系芽變，揭示轉(zhuǎn)座插入和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間重組是蘋果無性系變異的重要機(jī)制[44]。利用IRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的蘋果指紋圖譜，可以作為短枝和著色芽變鑒定的依據(jù)[45]。基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子引物IRAP標(biāo)記可鑒定遺傳背景高度相似的磨盤柿芽變[46]。林曉紅等利用IRAP標(biāo)記技術(shù)研究中國水仙自然變異體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間重組是中國水仙變異的重要機(jī)制[47]。IRAP引物標(biāo)記可用于分析金棗柿實(shí)生后代的遺傳變異[48]。利用基于旱酥梨及其紅皮芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)可以建立DNA指紋圖譜[49]。

成文革等用REMAP標(biāo)記技術(shù)分析吉生羊草體細(xì)胞無性系變異，發(fā)現(xiàn)其遺傳相似性系數(shù)范圍比ISSR技術(shù)要大[50]。馮榮芳等用基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的REMAP標(biāo)記技術(shù)證實(shí)紅翎菜科海藻存在較高程度變異[51]。基于AhMITE1轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)可以有效鑒定花生F1代雜種的真實(shí)性[52]。利用AhMITE1轉(zhuǎn)座子標(biāo)記可對栽培種花生F1代雜交種子的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定[53]。基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在變異鑒定中的應(yīng)用詳見表2。

表2 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在變異鑒定中的應(yīng)用

3.3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

基于Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的引物可以分析棉屬不同種，構(gòu)建棉花高密度遺傳圖譜[54]。王利英等根據(jù)大麥和煙草反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Bare-1、Tto1的LTR區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了茄子IRAP和REMAP分子標(biāo)記技術(shù)體系[55]。用基于煙草反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tnt1的LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的引物可將32個(gè)百合品種完全區(qū)分[56]。李芳等利用基于蘿卜Ty1-copia 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了14個(gè)蘿卜品種指紋圖譜[57]。在基于MITEs結(jié)構(gòu)特征開發(fā)的119條引物中，21個(gè)MITEs位點(diǎn)間多態(tài)性(inter-MITE polymorphism，簡稱IMP)標(biāo)記可以整合定位到1個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜上[58]。基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用詳見表3。

表3 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用

4 結(jié)論

植物轉(zhuǎn)座子是廣泛分布于植物基因組中的一類可移動元件，可分為DNA轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。植物轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)豐富、插入位點(diǎn)多態(tài)性、高度異質(zhì)性等特點(diǎn)，非常適合用來開發(fā)分子標(biāo)記。本研究在了解國內(nèi)外研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，分析基于植物轉(zhuǎn)座子的S-SAP、IRAP、REMAP、RBIP等分子標(biāo)記差異，歸納了這些標(biāo)記在遺傳多樣性分析、變異鑒定以及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面的應(yīng)用。隨著越來越多植物全基因組序列的發(fā)布，在全基因組水平上鑒定植物轉(zhuǎn)座子、高通量開發(fā)基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記將成為可能。