3種酚類物質(zhì)對油茶炭疽病病菌的抑菌機(jī)制

楊 婷， 李仟仟， 史紅安， 吳梅風(fēng)， 張志林， 王立華

(1.湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北孝感 432000；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430062)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellial)植物，為我國特有的優(yōu)質(zhì)食用油料植物[1]。茶油易被人體吸收，且煙點(diǎn)高，不含對人體有害的黃曲霉毒素、棉酚、芥酸等成分[2-3]。此外，茶油還具有保健功能，能提高人體免疫能力，減輕脂肪堆積，降低血漿中膽固醇濃度，有效改善和預(yù)防高血壓、冠心病、動(dòng)脈硬化等心血管疾病[4-6]，是一種高檔的保健食用油。茶油被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織作為重點(diǎn)推廣對象[7]。但是隨油茶種植面積的增加，油茶病害日趨嚴(yán)重，生產(chǎn)綠色無公害茶油，已成為我國油茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展急需解決的關(guān)鍵問題[8]。

油茶炭疽病病菌(Colletotrichumgloeosprioides)是油茶的主要病害之一，嚴(yán)重影響油茶的生長和產(chǎn)量[9]。萜類化合物為植物代謝的主要產(chǎn)物，具有抑菌活性強(qiáng)、低毒、易降解、不污染環(huán)境、不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，是一種安全高效的天然殺菌劑[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，萜類化合物中香芹酚、丁香酚、異丁香酚對油茶炭疽病病菌具有較好的抑制活性。本試驗(yàn)研究香芹酚、丁香酚、異丁香酚對油茶炭疽病病菌細(xì)胞膜通透性、可溶性蛋白和還原糖含量的影響，了解其作用機(jī)制，以期為將香芹酚、丁香酚、異丁香酚開發(fā)成天然殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試萜類化合物

香芹酚(carvacrol)、丁香酚(eugenol)、異丁香酚(isoeugenol)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度大于95%。

1.2 供試病原菌

油茶炭疽病病菌從湖北省孝感市區(qū)植物病株上采得，采用常規(guī)組織分離法分離純化病原菌，并觀察其形態(tài)學(xué)特征，同時(shí)結(jié)合rDNA-ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列分析，對病原菌進(jìn)行分離和分子鑒定得到[12]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 萜類化合物對病原菌菌絲形態(tài)的影響 在無菌條件下，用6 mm打孔器在培養(yǎng)好的供試菌菌落邊緣打取長勢相同的菌餅接入萜類化合物系列濃度梯度為50、100、200、400 μg/mL 的PDA培養(yǎng)基平板中，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，以不加藥的PDA平板作為對照，培養(yǎng)6 d后，挑取菌落邊緣的菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化。

1.3.2 細(xì)胞膜通透性試驗(yàn) (1)菌絲體培養(yǎng)。將油茶炭疽菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，取直徑為6 mm的菌餅數(shù)，放入含有200 mL PD培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)7 d(28 ℃，180 r/min)。在無菌條件下將菌絲團(tuán)取出，用滅菌的去離子水沖洗3次后，再用布氏漏斗抽濾，收集菌絲體。

(2)電導(dǎo)率測定。稱取1 g菌絲，放入含有100 mL滅菌去離子水的三角瓶中，分別加入香芹酚、丁香酚、異丁香酚至系列濃度梯度(50、100、200、400 μg/mL)，以無菌去離子水加溶劑作為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次，于搖床上振蕩培養(yǎng)(28 ℃，180 r/min)，室溫下，于0、30、60、90、120 min時(shí)測定電導(dǎo)率。根據(jù)下式計(jì)算各處理隨時(shí)間的延長引起的電導(dǎo)率增加的幅度：

電導(dǎo)率增幅=(不同時(shí)間電導(dǎo)率-0 min時(shí)的電導(dǎo)率)/0 min時(shí)的電導(dǎo)率×100%。

1.3.3 可溶性蛋白含量測定 (1)菌絲體培養(yǎng)。具體方法同“1.3.1”節(jié)。

(2)酶液制備。稱取5 g菌絲，放于含有100 mL PD培養(yǎng)基的三角瓶中懸浮，分別加入香芹酚、丁香酚、異丁香酚至系列濃度梯度(50、100、200、400 μg/mL)，以無菌去離子水加溶劑作為對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。處理12 h后，在無菌條件下將菌絲取出，用磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH值為7.5)沖洗2次，之后用布氏漏斗抽濾。稱取0.5 g菌絲，移入加有2 mL磷酸緩沖液的研缽中，冰浴下研磨至糊狀，加入磷酸緩沖液至體積為10 mL，于4 ℃離心(12 000 r/min)15 min，收集上清液備用。

(3)可溶性蛋白含量的測定。采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白含量，吸取1 mL酶液至10 mL離心管中，再加入 5 mL 考馬斯亮藍(lán)，搖勻，靜止5 min，以1 mL蒸餾水+5 mL考馬斯亮藍(lán)作為空白對照，于595 nm測定吸光度，每個(gè)處理重復(fù)3次。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得蛋白質(zhì)含量，根據(jù)以下公式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量(mg/g)：

樣品中蛋白質(zhì)含量=C×Vt/(Vs×WF×1 000)。

式中：C為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得含量μg/g；Vt為提取液總體積，mL；Vs為測定時(shí)加樣量，mL；WF為樣品鮮質(zhì)量，g。

1.3.4 還原糖含量的測定 菌絲體培養(yǎng)同“1.3.1”節(jié)，酶液制備同“1.3.3”節(jié)。還原糖含量的測定：用二硝基水楊酸(DNS)法測還原糖含量，取制備的酶液1 mL，空白對照用去離子水代替，加入2 mL DNS，于沸水中加熱5 min，取出后立即浸入冷水中冷卻至室溫，再加去離子水定容至10 mL，在540 nm處比色并記錄D540 nm，重復(fù)3次，取平均值。還原性糖含量(mg/g)計(jì)算公式如下：

樣品中還原糖含量=(a×Vt/V)/m。

式中：A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的還原糖含量，mg/g；Vt為提取液總體積，mL；V為測定液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Execl 2010和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，處理間差異多重比較采用Duncan氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酚類物質(zhì)對病原菌菌絲形態(tài)的影響

由酚類對供試病原菌菌絲生長抑制效果(圖1)可以看出，香芹酚、丁香酚、異丁香酚對供試菌具有明顯的抑制作用，且菌落直徑隨著酚類物質(zhì)濃度的增加而變小。同時(shí)，經(jīng)醛類化合物處理后的菌絲粗細(xì)不均、畸形、發(fā)生扭曲、分支增多(圖2)。

2.2 對油茶炭疽菌細(xì)胞膜通透性的影響

酚類物質(zhì)對油茶炭疽菌菌絲電導(dǎo)率變化的測定結(jié)果表明，油茶炭疽菌菌絲處理液的電導(dǎo)率均隨著處理時(shí)間的延長而升高，且電導(dǎo)率增幅均隨著酚類物質(zhì)濃度的增大而増大(圖3～圖5)。

香芹酚處理30 min時(shí)，50、100 μg/mL濃度的電導(dǎo)率增幅變化不大；當(dāng)處理時(shí)間大于30 min時(shí)，濃度為 100 μg/mL 的電導(dǎo)率增幅明顯高于濃度為50 μg/mL的。丁香酚處理 30～60 min時(shí)，50、100、200 μg/mL濃度處理下的電導(dǎo)率增幅較小，60 min后電導(dǎo)率增幅隨著濃度的增加而上升。異丁香酚處理濃度為50 μg/mL時(shí)，電導(dǎo)液的電導(dǎo)率與對照無明顯差異，在100、200、400 μg/mL濃度下，電導(dǎo)液的電導(dǎo)率增幅明顯高于對照。

2.3 油茶炭疽菌菌絲的可溶性蛋白含量

處理12 h后，油茶炭疽菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量測定結(jié)果表明，油茶炭疽菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量均隨著濃度的降低而下降(表1)。當(dāng)香芹酚、丁香酚、異丁香酚濃度為400 μg/mL時(shí)，可溶性蛋白含量最低，分別為7.55、7.69、8.01 mg/g，與對照相比分別下降了46.49%、45.50%、43.23%。

2.4 還原糖含量的測定結(jié)果

由表2可以看出，經(jīng)香芹酚、丁香酚、異丁香酚處理后，膠孢炭疽菌菌絲體內(nèi)還原糖含量都隨著濃度的升高而下降，當(dāng)酚類物質(zhì)濃度為400 μg/mL時(shí)，還原糖含量最低，分別為 4.95、6.18、5.71 mg/g，較對照分別下降59.82%、49.84%、53.65%。

3 討論與結(jié)論

菌體細(xì)胞膜為菌體的保護(hù)屏障，能調(diào)節(jié)和選擇物質(zhì)進(jìn)出。

表1 3種酚類物質(zhì)對油茶炭疽菌菌絲可溶性蛋白含量的影響

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

膜通透性增大是細(xì)胞膜受到損傷的主要表現(xiàn)之一。細(xì)胞膜受到損害后，其通透性增大，不能有選擇地運(yùn)送細(xì)胞內(nèi)外的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物外泄，使菌絲體失去正常生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，擾亂代謝途徑，從而迫使菌體死亡[13]。

表2 3種酚類物質(zhì)對油茶炭疽菌菌絲還原糖含量的影響

Odds等研究表明，作用于細(xì)胞膜的抑菌物質(zhì)可使細(xì)胞膜通透性增大，使其內(nèi)含物如蛋白質(zhì)、核酸、還原糖、金屬離子Na+、K+等外泄[14-15]。在本試驗(yàn)中，經(jīng)酚類物質(zhì)處理后，炭疽菌菌體液電導(dǎo)率隨著處理時(shí)間的延長而呈逐漸上升的趨勢，并且隨著酚類物質(zhì)濃度的增加，電導(dǎo)率增幅增加。汪金蓮等研究茶多酚對稻瘟病菌的抑制得出，茶多酚使稻瘟病菌的細(xì)胞膜通透性增大，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使其失去保護(hù)屏障，由此達(dá)到抑菌目的[16]。由此推測，酚類對炭疽菌抑菌活性是其損傷或破壞菌體細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大量內(nèi)含物外泄，最終導(dǎo)致菌體死亡，但是其具體作用位點(diǎn)還須進(jìn)一步研究。

彭璇等研究白薇提取液對意大利青霉的抑菌機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，其提取液可以降低意大利青霉菌菌絲體內(nèi)總糖、可溶性蛋白含量[17]。蛋白質(zhì)是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分之一，是菌絲維持生命活動(dòng)所需的基本物質(zhì)[18]。菌體內(nèi)蛋白質(zhì)含量減少，會(huì)使菌絲體生長受到影響。經(jīng)香芹酚、丁香酚、異丁香酚處理后，油茶炭疽菌菌絲體內(nèi)可溶性蛋白含量都隨著處理液濃度的升高而下降。周夢嬌等研究發(fā)現(xiàn)，桂枝提取物對指狀青霉具有抑制作用，通過測定其電導(dǎo)率變化、可溶性蛋白質(zhì)和總糖含量，研究其抑菌機(jī)制，結(jié)果表明，指狀青霉金桂枝提取物經(jīng)處理后，菌絲體內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖含量均減少[19]。

還原糖是菌體細(xì)胞的主要能源物質(zhì)之一，是維持病原菌細(xì)胞正常生理代謝所需的能量來源和物質(zhì)基礎(chǔ)，還原糖的利用率直接影響菌絲生長和繁殖[20-22]。在本研究中，2種病原菌經(jīng)處理后，體內(nèi)還原糖含量減少，且含量隨著酚類物質(zhì)濃度的升高而降低，表明萜類物質(zhì)促進(jìn)菌體細(xì)胞內(nèi)還原糖的分解，使菌體失去能量物質(zhì)，擾亂菌體的生理代謝，從而導(dǎo)致菌體死亡。

綜上述分析，萜類化合物香芹酚、丁香酚、異丁香酚增大了供試菌的細(xì)胞膜透性，使菌體內(nèi)含物外泄或抑制菌體內(nèi)能量物質(zhì)的合成代謝，從而到達(dá)抑菌目的。