3種酚類物質對油茶炭疽病病菌的抑菌機制

楊 婷， 李仟仟， 史紅安， 吳梅風， 張志林， 王立華

(1.湖北工程學院特色果蔬質量安全控制湖北省重點實驗室/湖北工程學院生命科學技術學院，湖北孝感 432000；2.湖北大學生命科學學院，湖北武漢 430062)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellial)植物，為我國特有的優質食用油料植物[1]。茶油易被人體吸收，且煙點高，不含對人體有害的黃曲霉毒素、棉酚、芥酸等成分[2-3]。此外，茶油還具有保健功能，能提高人體免疫能力，減輕脂肪堆積，降低血漿中膽固醇濃度，有效改善和預防高血壓、冠心病、動脈硬化等心血管疾病[4-6]，是一種高檔的保健食用油。茶油被聯合國糧食及農業組織作為重點推廣對象[7]。但是隨油茶種植面積的增加，油茶病害日趨嚴重，生產綠色無公害茶油，已成為我國油茶產業可持續發展急需解決的關鍵問題[8]。

油茶炭疽病病菌(Colletotrichumgloeosprioides)是油茶的主要病害之一，嚴重影響油茶的生長和產量[9]。萜類化合物為植物代謝的主要產物，具有抑菌活性強、低毒、易降解、不污染環境、不易產生抗性等優點，是一種安全高效的天然殺菌劑[10-11]。前期研究發現，萜類化合物中香芹酚、丁香酚、異丁香酚對油茶炭疽病病菌具有較好的抑制活性。本試驗研究香芹酚、丁香酚、異丁香酚對油茶炭疽病病菌細胞膜通透性、可溶性蛋白和還原糖含量的影響，了解其作用機制，以期為將香芹酚、丁香酚、異丁香酚開發成天然殺菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試萜類化合物

香芹酚(carvacrol)、丁香酚(eugenol)、異丁香酚(isoeugenol)購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，純度大于95%。

1.2 供試病原菌

油茶炭疽病病菌從湖北省孝感市區植物病株上采得，采用常規組織分離法分離純化病原菌，并觀察其形態學特征，同時結合rDNA-ITS(內轉錄間隔區)序列分析，對病原菌進行分離和分子鑒定得到[12]。

1.3 試驗方法

1.3.1 萜類化合物對病原菌菌絲形態的影響 在無菌條件下，用6 mm打孔器在培養好的供試菌菌落邊緣打取長勢相同的菌餅接入萜類化合物系列濃度梯度為50、100、200、400 μg/mL 的PDA培養基平板中，每個處理設3次重復，以不加藥的PDA平板作為對照，培養6 d后，挑取菌落邊緣的菌絲，在顯微鏡下觀察菌絲的形態變化。

1.3.2 細胞膜通透性試驗 (1)菌絲體培養。將油茶炭疽菌在PDA培養基上培養7 d，取直徑為6 mm的菌餅數，放入含有200 mL PD培養基的三角瓶中，培養7 d(28 ℃，180 r/min)。在無菌條件下將菌絲團取出，用滅菌的去離子水沖洗3次后，再用布氏漏斗抽濾，收集菌絲體。

(2)電導率測定。稱取1 g菌絲，放入含有100 mL滅菌去離子水的三角瓶中，分別加入香芹酚、丁香酚、異丁香酚至系列濃度梯度(50、100、200、400 μg/mL)，以無菌去離子水加溶劑作為對照，每個處理重復3次，于搖床上振蕩培養(28 ℃，180 r/min)，室溫下，于0、30、60、90、120 min時測定電導率。根據下式計算各處理隨時間的延長引起的電導率增加的幅度：

電導率增幅=(不同時間電導率-0 min時的電導率)/0 min時的電導率×100%。

1.3.3 可溶性蛋白含量測定 (1)菌絲體培養。具體方法同“1.3.1”節。

(2)酶液制備。稱取5 g菌絲，放于含有100 mL PD培養基的三角瓶中懸浮，分別加入香芹酚、丁香酚、異丁香酚至系列濃度梯度(50、100、200、400 μg/mL)，以無菌去離子水加溶劑作為對照，每個處理重復3次。處理12 h后，在無菌條件下將菌絲取出，用磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH值為7.5)沖洗2次，之后用布氏漏斗抽濾。稱取0.5 g菌絲，移入加有2 mL磷酸緩沖液的研缽中，冰浴下研磨至糊狀，加入磷酸緩沖液至體積為10 mL，于4 ℃離心(12 000 r/min)15 min，收集上清液備用。

(3)可溶性蛋白含量的測定。采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，吸取1 mL酶液至10 mL離心管中，再加入 5 mL 考馬斯亮藍，搖勻，靜止5 min，以1 mL蒸餾水+5 mL考馬斯亮藍作為空白對照，于595 nm測定吸光度，每個處理重復3次。通過標準曲線查得蛋白質含量，根據以下公式計算樣品中蛋白質含量(mg/g)：

樣品中蛋白質含量=C×Vt/(Vs×WF×1 000)。

式中：C為查標準曲線所得含量μg/g；Vt為提取液總體積，mL；Vs為測定時加樣量，mL；WF為樣品鮮質量，g。

1.3.4 還原糖含量的測定 菌絲體培養同“1.3.1”節，酶液制備同“1.3.3”節。還原糖含量的測定：用二硝基水楊酸(DNS)法測還原糖含量，取制備的酶液1 mL，空白對照用去離子水代替，加入2 mL DNS，于沸水中加熱5 min，取出后立即浸入冷水中冷卻至室溫，再加去離子水定容至10 mL，在540 nm處比色并記錄D540 nm，重復3次，取平均值。還原性糖含量(mg/g)計算公式如下：

樣品中還原糖含量=(a×Vt/V)/m。

式中：A為根據標準曲線計算得到的還原糖含量，mg/g；Vt為提取液總體積，mL；V為測定液體積，mL；m為樣品質量，g。

1.4 數據處理

試驗數據采用Execl 2010和SPSS 19.0統計分析軟件處理。用SPSS軟件進行單因素方差分析，處理間差異多重比較采用Duncan氏新復極差法。

2 結果與分析

2.1 酚類物質對病原菌菌絲形態的影響

由酚類對供試病原菌菌絲生長抑制效果(圖1)可以看出，香芹酚、丁香酚、異丁香酚對供試菌具有明顯的抑制作用，且菌落直徑隨著酚類物質濃度的增加而變小。同時，經醛類化合物處理后的菌絲粗細不均、畸形、發生扭曲、分支增多(圖2)。

2.2 對油茶炭疽菌細胞膜通透性的影響

酚類物質對油茶炭疽菌菌絲電導率變化的測定結果表明，油茶炭疽菌菌絲處理液的電導率均隨著處理時間的延長而升高，且電導率增幅均隨著酚類物質濃度的增大而増大(圖3～圖5)。

香芹酚處理30 min時，50、100 μg/mL濃度的電導率增幅變化不大；當處理時間大于30 min時，濃度為 100 μg/mL 的電導率增幅明顯高于濃度為50 μg/mL的。丁香酚處理 30～60 min時，50、100、200 μg/mL濃度處理下的電導率增幅較小，60 min后電導率增幅隨著濃度的增加而上升。異丁香酚處理濃度為50 μg/mL時，電導液的電導率與對照無明顯差異，在100、200、400 μg/mL濃度下，電導液的電導率增幅明顯高于對照。

2.3 油茶炭疽菌菌絲的可溶性蛋白含量

處理12 h后，油茶炭疽菌菌絲體內可溶性蛋白含量測定結果表明，油茶炭疽菌菌絲體內可溶性蛋白含量均隨著濃度的降低而下降(表1)。當香芹酚、丁香酚、異丁香酚濃度為400 μg/mL時，可溶性蛋白含量最低，分別為7.55、7.69、8.01 mg/g，與對照相比分別下降了46.49%、45.50%、43.23%。

2.4 還原糖含量的測定結果

由表2可以看出，經香芹酚、丁香酚、異丁香酚處理后，膠孢炭疽菌菌絲體內還原糖含量都隨著濃度的升高而下降，當酚類物質濃度為400 μg/mL時，還原糖含量最低，分別為 4.95、6.18、5.71 mg/g，較對照分別下降59.82%、49.84%、53.65%。

3 討論與結論

菌體細胞膜為菌體的保護屏障，能調節和選擇物質進出。

表1 3種酚類物質對油茶炭疽菌菌絲可溶性蛋白含量的影響

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

膜通透性增大是細胞膜受到損傷的主要表現之一。細胞膜受到損害后，其通透性增大，不能有選擇地運送細胞內外的營養物質和代謝產物，導致細胞內含物外泄，使菌絲體失去正常生長所需的營養物質，擾亂代謝途徑，從而迫使菌體死亡[13]。

表2 3種酚類物質對油茶炭疽菌菌絲還原糖含量的影響

Odds等研究表明，作用于細胞膜的抑菌物質可使細胞膜通透性增大，使其內含物如蛋白質、核酸、還原糖、金屬離子Na+、K+等外泄[14-15]。在本試驗中，經酚類物質處理后，炭疽菌菌體液電導率隨著處理時間的延長而呈逐漸上升的趨勢，并且隨著酚類物質濃度的增加，電導率增幅增加。汪金蓮等研究茶多酚對稻瘟病菌的抑制得出，茶多酚使稻瘟病菌的細胞膜通透性增大，從而破壞細胞膜的結構，使其失去保護屏障，由此達到抑菌目的[16]。由此推測，酚類對炭疽菌抑菌活性是其損傷或破壞菌體細胞膜的結構，導致大量內含物外泄，最終導致菌體死亡，但是其具體作用位點還須進一步研究。

彭璇等研究白薇提取液對意大利青霉的抑菌機制時發現，其提取液可以降低意大利青霉菌菌絲體內總糖、可溶性蛋白含量[17]。蛋白質是構成細胞膜的主要成分之一，是菌絲維持生命活動所需的基本物質[18]。菌體內蛋白質含量減少，會使菌絲體生長受到影響。經香芹酚、丁香酚、異丁香酚處理后，油茶炭疽菌菌絲體內可溶性蛋白含量都隨著處理液濃度的升高而下降。周夢嬌等研究發現，桂枝提取物對指狀青霉具有抑制作用，通過測定其電導率變化、可溶性蛋白質和總糖含量，研究其抑菌機制，結果表明，指狀青霉金桂枝提取物經處理后，菌絲體內可溶性蛋白、可溶性糖含量均減少[19]。

還原糖是菌體細胞的主要能源物質之一，是維持病原菌細胞正常生理代謝所需的能量來源和物質基礎，還原糖的利用率直接影響菌絲生長和繁殖[20-22]。在本研究中，2種病原菌經處理后，體內還原糖含量減少，且含量隨著酚類物質濃度的升高而降低，表明萜類物質促進菌體細胞內還原糖的分解，使菌體失去能量物質，擾亂菌體的生理代謝，從而導致菌體死亡。

綜上述分析，萜類化合物香芹酚、丁香酚、異丁香酚增大了供試菌的細胞膜透性，使菌體內含物外泄或抑制菌體內能量物質的合成代謝，從而到達抑菌目的。