D-Optional混料設計優化油茶殼瓶栽海鮮菇配方

盧劍青， 艾嘯威， 胡冬南， 沈勇根， 周 明， 朱鳳妮， 王 強

(1.江西農業大學食品科學與工程學院/江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西南昌 330045；2.江西農業大學林學院，江西南昌 330045)

油茶(CamelliaOleiferaAbel)別稱茶油樹，為山茶科山茶屬植物，同油棕、椰子、油橄欖一起被人們譽為世界四大木本油料樹種[1]。據報道，中國是世界上油茶品種最多、種植面積最大、分布最廣、茶籽產量亦是最高的國家，已有 26.67萬hm2的油茶林種植面積[2]。油茶殼含油率低、木質素高，將油茶籽帶殼加工制油，不僅會增大對設備的損耗，而且還會降低茶油的品質，所以在制油工業中都是對油茶籽進行脫殼處理，油茶殼成了茶油加工中的主要廢棄物。海鮮菇[Hypsizygusmarmoreus(Peck) H.E.Bigelow]是一種珍稀的食用菌，其商品名為真姬菇，別稱白玉菇、玉蕈、斑玉蕈或蟹味菇等。海鮮菇整體顏色潔白，菇柄筆直，外形十分美觀，口感爽滑、脆嫩，味道鮮美。海鮮菇風味鮮美類似海蟹風味、營養價值高，并且海鮮菇還有著很高的藥用價值，經國內外對海鮮菇的研究發現，海鮮菇子實體中含有多種生物活性物質，如具有清除自由基[3]、抗腫瘤[4]以及調節免疫活性[5]等生理功能，近年來廣受大眾歡迎。將油茶殼廢料應用到食用菌生產中作栽培基質，在獲得風味獨特的食用菌同時，消化油茶加工過程中產生的剩余物，使資源得到充分高效循環利用。大量研究表明，油茶殼經過堆漚發酵后，碳氮比會降低(即油茶殼的含氮量提高)，顆粒度變小使保水能力增強，經過半年的發酵，油茶殼的碳氮比高達21.42 ∶1，發酵后的油茶殼很適合用作食用菌的栽培原料[6]。這在鳳尾菇[7]、黑木耳[8]、香菇[9]、金針菇[10]、平菇[11]等幾種食用菌的栽培中已有應用，并且使用油茶殼栽培食用菌后，食用菌生長速率快、產量高、生物學效率高、品質好。目前，在海鮮菇生產企業中主要采用棉籽殼來栽培海鮮菇，但棉籽殼的原料價格一直居高不下，海鮮菇的經濟收益低，因此海鮮菇科技工作者開始研究新型栽培料代替傳統原料來生產海鮮菇，以降低海鮮菇生產成本，提高效率。本研究將油茶殼應用到海鮮菇生產中作栽培基質，采用混料設計方法，以油茶殼、棉籽殼、混合料(木屑、麥麩、玉米粉)為主要原料，以栽培周期、產量、子實體農藝性狀和營養價值為評價指標，設計16組配方進行栽培試驗，分析并篩選出適宜海鮮菇工廠化栽培的優勢配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海鮮菇菌種，由江西星火農林科技有限公司提供；油茶殼，經堆漚發酵，由江西星火農林科技有限公司提供；海鮮菇母種培養基包括馬鈴薯200 g、瓊脂粉18 g、葡萄糖20 g、水 1 000 mL 等，市購；海鮮菇原種培養基包括棉籽殼26.7%、木屑53.3%、玉米粉3.3%、麥麩16.7%，其中石灰粉和石膏粉的用量占培養基干質量的1%，市購；海鮮菇栽培種培養基包括油茶殼、棉子殼、雜木屑、麥麩粉、玉米粉、石灰粉，棉籽殼和油茶殼作為主料，雜木屑、麥麩粉以及玉米粉按固定比例(4 ∶3 ∶1)混合作為混合料，市購；過氧化氫、氫氧化鈉、濃硫酸、濃鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、無水乙醇、甲基紅、溴甲酚綠、過氧化氫、十二烷基三甲基溴化氨、正丁醇、丙酮、石油醚等，分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺，上海康福特環境科技有限公司；HVE-50滅菌鍋，日本Hirayama制造有限公司；DHP-9272恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司；BZ-10-12型馬弗爐，上海博珍儀器設備制造廠；BAS124S型分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；BZ-10-12型馬弗爐，上海博珍儀器設備制造廠；Foss8400型全自動凱氏定氮儀，廣東省廣州賽為思儀器設備有限公司；DT208型樣品消化爐，廣東省廣州賽為思儀器設備有限公司；SHZ-ⅢD型真空抽濾機，上海亞京生化儀器廠；HH-4型電熱水浴鍋，國華電器有限公司；HJ-3型磁力攪拌器，國華電器有限公司；101A-4B型電熱恒溫箱，上海市試驗儀器總廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 混料配方設計 采用D-Optional混料設計法，根據海鮮菇對碳源和氮源的營養需要，調整棉籽殼、油茶殼及混合料所占培養基干料的比例，石灰粉的添加量固定為培養基干質量的1.4%，以期建立各因子對海鮮菇生長周期、產量及農藝性狀的回歸方程，通過統計軟件來優化海鮮菇的生產配方。在采用D-Optional優化處方工藝前，各因素需要1個較優范圍，以便于保證優化設計的精確性。本研究前期通過查閱大量文獻以及根據實際生產經驗得出結果，將3種栽培料的添加量分別限定為：0≤棉籽殼添加量(A)≤70%，0≤油茶殼添加量(B)≤70%，30%≤混合料添加量(C)≤50%；A、B、C均為實際值，且A+B+C=1。根據D-Optional設計出16組配方，具體結果見表1。同時，以傳統未加油茶殼的配方(棉籽殼添加量65%、混合料添加量35%)進行對比，每組配方做32次重復試驗。

表1 培養基配方設計

1.3.2 各級種子的制備

1.3.2.1 母種斜面的制備 先挑取母種轉接到馬鈴薯瓊脂培養基(PDA)上，于恒溫培養箱20～22 ℃遮光培養，3 d后母種萌發菌絲，15～20 d后雪白的菌絲長滿整個試管。將培養好的馬鈴薯瓊脂斜面培養基(PDA)試管的培養物放在4 ℃下保藏，作為母種斜面。

1.3.2.2 原種的制備 (1)培養基的制備。稱取200 kg棉籽殼、400 kg雜木屑分別先用水浸泡12 h以上，再將浸泡好的棉籽殼、雜木屑同125 kg麥麩、10 kg玉米粉、7.5 kg石灰粉以及7.5 kg石膏進行攪拌均勻，加水至培養料的含水量為65%為止。隨后進行裝瓶，于121～123 ℃下濕熱高壓滅菌處理20 min；待滅菌完成后，將培養料冷卻至室溫，方可用于后續接種試驗。(2)原種的制備。取出制備好的母種斜面試管，用接種環將母種斜面平均切成3～4塊，分別放入原種瓶中，每支母種斜面試管接3～4個原種瓶，最后將接種好的原種瓶直接擺放在原種培養房的培養架上，于22～25 ℃下暗培養 30～40 d，室內的相對濕度(RH)控制在65%～75%。待培養好的原種瓶內的培養物作為原種。

1.3.2.3 栽培種的制作 (1)拌料。將預先處理好的油茶殼、棉籽殼、雜木屑、麥麩、玉米粉栽培料、石灰粉按比例堆放在一起，用鐵鍬不斷攪拌均勻，加入適量水，直到混合料的含水量為65%上下為止。(2)裝瓶及接種。將拌好的混合料按300 g分裝于栽培瓶(1 100 mL)，且保證每瓶料的松緊度和高度一致，于121～123 ℃下高壓滅菌20 min。待滅菌完成且冷卻至室溫后，將制備好的原種接種于無菌的栽培瓶中，于培養室22～25 ℃下暗培養和后熟一段時間，且室內的相對濕度控制在65%～75%。(3)搔菌。待海鮮菇成熟后進行搔菌，將菌瓶放在搔菌機上，機器把菌瓶上部與瓶蓋接觸的那部分老菌絲挖掉，搔菌后每瓶加入10～15 mL的水，5 min后把水倒出，然后把菌瓶轉移至出菇房進行出菇管理。為保證菌瓶正常出菇，將出菇房中的溫度控制在13～15 ℃，相對濕度控制在85%，再把無紡布蓋在菌瓶面上避免空調機吹出來的風直接打在料面上。待3～5 d的暗培養后，用150～200 lx的光線對其進行照射，10～15 d后瓶口出現小菇芽，可揭開無紡布，以保證正常出菇，此時將出菇房的相對濕度控制在90%。待海鮮菇菇帽出現菌環時，表明海鮮菇已經成熟，必須馬上采摘，否者會形成“大帽子菇”影響海鮮菇的商品價值。

1.3.3 試驗各指標測定方法

1.3.3.1 海鮮菇栽培周期指標的測定方法 采用觀察法，觀察并記錄接種好的栽培瓶內海鮮菇菌絲長滿至全瓶所需要的時間和出菇至菇芽成熟所需要的時間，這兩者之和即為海鮮菇的栽培周期。

1.3.3.2 海鮮菇子實體產量指標的測定方法 子實體的產量采用直接稱質量法，將采摘后的子實體用電子天平稱質量。

1.3.3.3 海鮮菇子實體農藝性狀指標的測定方法 結合工廠生產對海鮮菇子實體實際需要，采用測量評分法，待出菇至菇芽成熟結束后，按表2進行評分。

1.3.3.4 海鮮菇子實體營養指標的測定方法 含水量參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中直接干燥法進行測定[12]；灰分含量的測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》中進行測定[13]；粗蛋白質含量參照GB 5009.5—2016 《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中全自動凱氏定氮儀法進行測定[14]；粗纖維含量采用酸性洗滌劑法進行測定[15]；粗脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中索氏提取法進行測定[16]。

表2 子實體農藝性狀的評分標準

2 結果與分析

2.1 不同配方海鮮菇子實體比較

不同配方海鮮菇子實體的生長情況見圖1。

2.2 不同配方對海鮮菇栽培周期、子實體產量及農藝性狀的影響

將成熟的海鮮菇子實體采下，測量不同配方海鮮菇子實體的數量、菇柄直徑及其長度、菇帽的直徑，并根據表2中評分標準對海鮮菇子實體進行評分，評分結果見表3。

2.2.1 不同配方對海鮮菇栽培周期回歸分析結果 根據所得到的試驗結果，對海鮮菇栽培周期的數據進行回歸擬合。根據擬合結果，該模型擬合有統計學意義(P=0.012 1<0.05)，對試驗數據進行回歸分析，得到回歸方程：y=48.882A+88.702B+10.478C-61.824AB+394.419AC+228.249BC。從表4可以看出該模型的P值=0.001 1，達顯著水平，失擬項為0.106 6，不顯著，確定系數R2=0.835 1>0.7，說明83.51%的試驗數據可以用該模型解釋，表明該模型擬合效果較好。

由圖2可知，當混合料添加量占較大的比例，隨著棉籽殼添加量增加，海鮮菇的生長周期逐漸延長，隨著油茶殼的添加量不斷增加，海鮮菇的生長周期先是不斷縮短再開始緩慢延長，在油茶殼添加量為50%時，海鮮菇的生長周期最短。油茶殼經過發酵后，原料的持水性得到提高，同時發酵后的油茶殼中的營養物質易被海鮮菇菌絲吸收，隨著油茶殼的添加量增加，海鮮菇生長周期縮短，但是油茶殼添加量過高時，導致培養基整體的透氣性下降，影響海鮮菇菌絲正常生長。以海鮮菇子實體栽培周期為評價指標，最佳栽培料的生產配方：油茶殼添加量為50%、棉籽殼添加量為0、混合料添加量為50%，并且預計海鮮菇最短栽培周期是107 d。

表3 不同配方栽培周期、子實體產量及農藝性狀評分試驗結果

表4 栽培周期回歸分析結果

2.2.2 不同配方對海鮮菇子實體產量回歸結果 根據所得到的試驗結果，對海鮮菇子實體產量的數據進行回歸擬合。根據擬合結果可知，該模型擬合有統計學意義(P<0.000 1)，對試驗數據進行回歸分析，得到回歸方程如下：y=91.876A+119.713B+173.053C+214.987AB+459.389AC。從表5中可以看出該模型P值<0.0001，達顯著水平，其決定系數R2=0.987>0.7，說明98.7%的試驗數據可以用該模型解釋，表明該模型擬合效果較好。

表5 子實體產量回歸分析結果

由圖3中可知，當混合料添加量同時保持不變時，海鮮菇的產量隨著棉籽殼的添加量增加而增加，隨著油茶殼添加量的增加而減少，在棉籽殼的添加量在50%時，產量有最大值。當油茶殼添加量較少且固定時，海鮮菇產量隨著棉籽殼添加量增加而減少，隨著混合料添加量增加而增加。這可能是因為油茶殼發酵后致密性增強導致海鮮菇在出菇階段營養吸收不足，從而導致海鮮菇產量下降。由統計軟件預測得出，以海鮮菇子實體產量為評價指標，最佳栽培料的生產配方為：油茶殼添加量0、棉籽殼添加量50%、混合料添加量50%，預計最高產量約為247.3 g。

2.2.3 不同配方對海鮮菇子實體的農藝性狀回歸分析結果 根據所得到的試驗結果，對海鮮菇子實體農藝性狀的數據進行回歸擬合。根據擬合結果可知，該模型擬合具有統計學意義(P<0.000 1)，對試驗數據進行回歸分析，得到回歸方程如下：y=4.650A-0.089B+2.044C-42.326AB+22.173AC+15.849BC+167.312ABC。從表6中可以看出模型P值<0.000 1，達顯著水平，其決定系數R2=0.989 5>0.7，說明98.95%的試驗數據可以用該模型解釋，表明模型擬合效果較好。

表6 子實體農藝性狀回歸分析結果

由圖4可知，當混合料添加量固定且較大時，海鮮菇子實體農藝性狀評分隨著棉籽殼添加量增加先提高，當棉籽殼添加量35.5%時，海鮮菇農藝性狀評分有最大值，之后隨著棉籽殼添加量增大而降低，隨著油茶殼添加量增大而提高，直到油茶殼添加量為15.6%時達到最大值，之后隨著油茶殼添加量增大而降低。這可能是因為油茶殼致密性高導致海鮮菇在出菇階段營養吸收不足，從而導致農藝性狀評分下降。以海鮮菇子實體農藝性狀為評價指標，最佳栽培料的生產配方：油茶殼添加量15.6%、棉籽殼添加量35.5%、混合料添加量48.9%，預計子實體農藝性狀得分最高值為9.9分。

2.3 傳統生產配方的海鮮菇品質

采用傳統工廠生產配方(棉籽殼添加量65%、混合料添加量35%)，按上述相關指標進行測定，得出其生長周期為130 d，產量205 g，農藝性狀評分為8.6分。

2.4 工廠化生產配方的設計

為滿足工廠化生產的需要，必須結合實際來設計最佳配方，須要考慮以下幾點因素：海鮮菇栽培周期時間不能太長，否則會直接加大海鮮菇成本；海鮮菇產量不能太低，否則直接會加大海鮮菇成本；子實體農藝性狀不能太差，否則會導致海鮮菇將難以銷售。

根據實際生產經驗，設定海鮮菇栽培周期的范圍在 110～131 d、海鮮菇產量范圍在200～251 g、子實體農藝性狀評分范圍在8.6～9.4分，采用統計軟件Design-Expert 8.0.6 進行模型分析，得到最適合工廠化的配方為：油茶殼添加量21.8%、棉籽殼添加量42.8%、混合料添加量35.4%。通過采用統計軟件Design-Expert 8.0.6預測該配方栽培周期為115 d、產量為216.4 g、子實體農藝性狀評分為8.9分。并對該配方進行驗證試驗，結果顯示，海鮮菇生長周期為 115 d、產量217.1 g、農藝性狀為8.8分。與傳統未加油茶殼的配方(棉籽殼添加量65%，混合料添加量35%)相比，該配方的生產周期縮短了15 d、產量增加了11.4 g。

2.5 優化配方和傳統配方海鮮菇子實體營養品質的比較

由表7可知，采用優化后的配方瓶栽的海鮮菇的灰分、粗蛋白質及粗纖維含量均顯著高于傳統配方瓶栽的海鮮菇，這可能是油茶殼經過發酵以后，其微量元素、氮、有機質含量增加，導致優化后配方的海鮮菇灰分、蛋白及纖維較高。但2種海鮮菇的水分及粗脂肪含量均無顯著的差異，同時其子實體的水分低于91%，有利于海鮮菇的貯藏。采用優化后的配方瓶栽海鮮菇，含水量不僅保持在90%左右，而且脂肪含量低、蛋白質、纖維素含量高，滿足人們對營養和健康的要求。

表7 優化配方和傳統配方海鮮菇子實體營養品質的比較

3 結論

采用混料設計方法[17]，以油茶殼、棉籽殼、混合料(木屑、麥麩、玉米粉)為主要原料，設計16組配方進行栽培試驗，通過對試驗數據進行回歸分析，建立了栽培周期、產量、子實體農藝性狀與響應值的回歸方程，分別為：y周期=48.882A+88.702B+10.478C-61.824AB+394.419AC+228.249BC；y產量=91.876A+119.713B+173.053C+214.987AB+459.389AC；y農藝性狀=4.650A-0.089B+2.044C-42.326AB+22.173AC+15.849BC+167.312ABC。對回歸方程進行方差分析，這3個回歸方程的決定系數都大于0.7，結果表明這3個回歸方程模型擬合性較好。

從不同配方對栽培周期的影響結果進行分析，當以海鮮菇子實體栽培周期為評價指標時，最佳栽培料的生產配方為：油茶殼添加量50%、棉籽殼添加量0、混合料添加量50%，并預計最短栽培周期為107 d；以海鮮菇子實體產量為評價指標，最佳栽培料的生產配方為：油茶殼添加量0、棉籽殼添加量50%、混合料添加量50%，并預計最高產量為247.3 g；以海鮮菇子實體農藝性狀為評價指標，最佳栽培料的生產配方：棉籽殼添加量35.5%、油茶殼添加量15.6%、混合料添加量48.9%，預計子實體農藝性狀最高的評分值為9.9分。

工廠化生產海鮮菇需要栽培周期短、產量高以及子實體農藝性狀好的生產配方，通過優化計算得到適合工業化生產的配方：油茶殼添加量21.8%、棉籽殼添加量42.8%、混合料添加量35.4%，與傳統配方相比，該配方具有栽培周期短、產量高的優勢，同時灰分、粗蛋白質及粗纖維含量高。