不同中藥提取物的免疫調節作用比較

楊海峰， 陳曉蘭， 邱樹磊， 武彩紅， 奚兆壽

(江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300)

近年來，在畜牧業中普遍存在著接種疫苗后仍然發生該病的流行，而雞群處于免疫抑制狀態是導致免疫失敗的重要原因[1]。要解決這一問題，就必須采取有效手段，激活免疫系統，使畜禽機體接種疫苗后能夠獲得較高水平的系統免疫應答和黏膜免疫應答水平，增強機體的抗病能力。中藥免疫增強劑因無公害、殘留少、毒副作用小、藥源廣泛、便于應用的優點日益受到人們的關注[2]。

我國為世界上桑葉主要生產國之一，桑葉藥材的資源尤為豐富，桑葉中營養豐富，含有人體必需的氨基酸、維生素、無機鹽、黃酮、生物堿等多種成分[3]。現代藥理證明桑葉具有多種藥理活性，如降血脂、降血糖、降血壓、抗衰老、抗腫瘤、抗菌等[4]，桑葉多糖具有增強機體免疫功能的作用[5]。杜仲屬于杜仲科植物，為中國特有的植物物種，亦為世界寶貴的藥源植物資源，具有延緩衰老、調血脂血壓、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤等藥理作用[6]。同時研究顯示，杜仲葉醇提取物[7]、杜仲葉浸提物[8]、杜仲葉多糖[9]、杜仲葉粉[10]均具有一定的增強免疫作用。

本研究以桑葉、杜仲、杜仲葉為原藥材，制備桑葉水提物(MLAE)、桑葉粗多糖(MLCP)、杜仲水提物(EUAE)、杜仲葉水提物(EULAE)、杜仲葉粗多糖(EULCP)，研究不同中藥提取物在不同給藥劑量下對雞新城疫疫苗血清抗體水平的影響，獲得系統免疫效果最佳中藥提取物及其給藥劑量。在此基礎上，研究最佳的中藥提取物對免疫新城疫疫苗雞呼吸道和腸道黏膜免疫功能的影響，綜合評價開發為免疫增強劑的可能性。本研究對于充分利用現有的豐富天然資源，盡可能發揮天然藥物的藥用性能具有顯著的研究價值，同時為篩選新型中藥免疫增強劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新城疫Ⅳ系苗(La Sota株)，購于青島易邦生物工程有限公司，批號(140325001)；新城疫檢測抗原，購于江蘇省農業科學院獸醫研究所；96孔微量血凝板，購于南通理能實驗器材有限公司；隔水式電熱恒溫培養箱，購于上海躍進醫療器械廠；高速離心機：BIOFUGE PRIMO R，購于Thermo公司；電子天平，FA1104N型，購于上海精密科學儀器有限公司。IgA酶聯免疫檢測試劑盒，購于上海朗頓生物科技有限公司。

1.2 試驗時間與地點

時間：2015年7—12月；地點：江蘇農牧科技職業學院科技樓。

1.3 藥物準備

桑葉，購于黃岡金貴中藥產業發展有限公司，批號D5090101；鹽杜仲，購于黃岡金貴中藥產業發展有限公司，批號D5010301；杜仲葉，購于安徽亳州，批號20150314；芪黃素，購于艾迪森(北京)生物科技有限公司，批號1402253。

1.3.1 桑葉水提物 取桑葉藥材500 g，加20倍量水，煎煮 2 h，4層紗布濾過，藥渣同法煎煮和濾過，合并濾液。濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液繼續濃縮為浸膏，后60 ℃干燥即得。

1.3.2 桑葉粗多糖 取桑葉藥材500 g，加20倍量水，煎煮 2 h，4層紗布濾過，藥渣同法煎煮和濾過，合并濾液。濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液加95%乙醇至含醇量為75%，靜置24 h，棄上液，沉淀60 ℃干燥，即得桑葉粗多糖。

1.3.3 杜仲水提物 取杜仲藥材500 g，加10倍量水，煎煮1.5 h，4層紗布濾過，藥渣加等量水，再煎煮1 h，濾過，合并濾液，濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液繼續濃縮至浸膏，60 ℃干燥即得。

1.3.4 杜仲葉水提物 取杜仲葉藥材500 g，加20倍量水，煎煮2 h，4層紗布濾過，藥渣同法煎煮和濾過，合并濾液。濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液繼續濃縮為浸膏，后60 ℃干燥即得。

1.3.5 杜仲葉粗多糖 取杜仲葉藥材500 g，加20倍量水，煎煮2 h，4層紗布濾過，藥渣同法煎煮和濾過，合并濾液。濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液加95%乙醇至含醇量為75%，靜置24 h，棄上液，沉淀60 ℃干燥，即得杜仲葉粗多糖。

1.4 動物分組與處理

試驗Ⅰ：1日齡非免疫健康雛雞，飼養至14 日齡時，檢測血清新城疫母源抗體效價，當低于4log2時正式試驗。選擇660羽隨機均分為33組，每組20羽。分別為桑葉水提物、桑葉粗多糖、杜仲水提物、杜仲葉水提物、杜仲葉多糖大組及芪黃素藥物對照組、免疫對照組和空白對照組，每大組設計2、4、8、12、16、24 mg(以總多糖含量計)6個劑量組。除空白對照組外，各組均采用NDV-IV疫苗滴鼻點眼免疫，1羽份/羽，28日齡進行二免。各給藥組于每次免疫前3 d開始給藥，連用7 d。給藥劑量為2、4、8、12、16、24 mg/羽(以多糖含量計)相應中藥提取物，均拌料給藥。藥物對照組芪黃素依據用藥說明給藥；免疫對照組(VC)和空白對照組(BC)不加任何藥物。

試驗Ⅱ：1日齡非免疫健康白羽蛋雞，飼喂商品化飼料(購于泰州正大飼料有限公司)，自由飲水。雛雞飼養至14日齡時，取240羽隨機均分為6組，除空白對照組外均用NDV-IV系疫苗滴鼻點眼免疫，28日齡二免。在每次免疫的前3 d，桑葉粗多糖的高(MLCPH)、中(MLCPM)、低(MLCPL)劑量組每羽分別飲服MLCP 8、4、2 mg(以桑葉粗多糖計)，連用7 d；藥物對照組芪黃素依據用藥說明給藥；免疫對照組(VC)和空白對照組(BC)不加任何藥物。分別于首免后7、14、21、28 d，每組隨機抽取6羽，測定氣管和空腸洗液中sIgA含量。

1.5 指標檢測

1.5.1 不同中藥提取物對雞ND血清抗體效價的影響 “試驗Ⅰ”分別于首免后7、14、21、28 d，各組隨機抽取10羽進行雞翼靜脈采血，采用血凝抑制試驗檢測血清新城疫抗體效價。

1.5.2 MLCP對雞呼吸道和小腸黏膜免疫功能的影響 分別于首免后7、14、21、28 d，從桑葉粗多糖的高(MLCPH)、中(MLCPM)、低(MLCPL)劑量組及芪黃素對照組、免疫對照組(VC)和空白對照組(BC)隨機抽取6羽雞，用CO2安樂死，切取長約5 cm氣管、空腸腸管，用止血鉗夾住氣管和腸管兩端，注射器注入含0.1%牛血清白蛋白和蛋白酶抑制劑的冰浴PBS溶液0.5 mL，將溶液在腸管內充分擠壓混勻3次后，收集所有腸洗液，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，收集上清液，-70 ℃ 保存，采樣全部完成后同時用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定洗液中sIgA的含量。

1.6 數據處理

數據以“平均值±標準誤”表示，采用SPSS 18.0軟件進行Duncan’s多重分析，比較各組血清ND抗體效價、氣管和空腸sIgA的含量，采用Graphpad Prism 5軟件繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 臨床體征觀察

試驗期間至結束，各給藥組雞精神狀態、采食、飲水均正常且生長良好。

2.2 血清抗體效價的變化

2.2.1 桑葉水提物對ND血清抗體水平的影響 首免后7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價均顯著高于空白對照組(P<0.05)。首免后7 d，8 mg劑量組抗體效價最高，顯著高于16、24 mg組和VC組(P<0.05)，但與其他給藥組比較差異不明顯(P>0.05)；首免后14 d，12 mg劑量組抗體效價最高，顯著高于除2、4 mg劑量組和芪黃素對照組外的其余各組(P<0.05)；首免后21 d，12 mg劑量組抗體效價依然最高，顯著高于16 mg和VC組(P<0.05)，與其他給藥組比較差異不明顯(P>0.05)；首免后28 d，各給藥組間無明顯差異(P>0.05)(圖1)。

2.2.2 桑葉粗多糖對ND血清抗體水平的影響 首免后7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價均顯著高于空白對照組(P<0.05)。首免后7 d，4 mg劑量組抗體效價最高，顯著高于12 mg組和VC組(P<0.05)，但與其他給藥組比較差異不明顯(P>0.05)；首免后14 d，4 mg劑量組和芪黃素對照組抗體效價最高，與2 mg劑量組和免疫對照組差異顯著(P<0.05)，但與其他給藥組比較差異不明顯(P>0.05)；首免后21 d，2 mg劑量組抗體效價依然最高，顯著高于除 12 mg、芪黃素對照組外的其余各組(P<0.05)；首免后28 d，8、12 mg組抗體效價最高，顯著高于除2、16 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)(圖2)。

2.2.3 杜仲水提物對ND血清抗體水平的影響 首免后7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價均顯著高于空白對照組(P<0.05)。首免后7 d，芪黃素對照組抗體效價最高，顯著高于除4 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)；首免后14 d，2 mg劑量組抗體效價最高，顯著高于除24 mg劑量組和芪黃素對照組外的其余各組(P<0.05)；首免后21 d，12 mg 劑量組抗體效價最高，顯著高于16 mg劑量組和免疫對照組(P<0.05)，與其他給藥組間無顯著性差異(P>0.05)；首免后28 d，2 mg劑量組抗體效價最高，顯著高于除24 mg和芪黃素對照組外的其余各組(P<0.05)(圖3)。

2.2.4 杜仲葉水提物對ND血清抗體水平的影響 在首免后7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價均顯著高于空白對照組(P<0.05)。首免后7 d，芪黃素對照組抗體效價最高，顯著高于除4、8 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)；首免后14 d，8 mg劑量組抗體效價最高，顯著高于免疫對照組(P<0.05)，但各給藥組間無顯著性差異(P>0.05)；首免后21 d，4 mg劑量組和芪黃素對照組抗體效價最高，顯著高于除2 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)；首免后28 d，16、24 mg劑量組抗體效價最高，顯著高于其余各組(P<0.05)(圖4)。

2.2.5 杜仲葉粗多糖對ND血清抗體水平的影響 首免后 7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價均顯著高于空白對照組(P<0.05)。首免后7 d，各給藥組與免疫對照組間無明顯差異(P>0.05)；首免后14 d，各給藥組顯著高于免疫對照組(P<0.05)，但各給藥組間無明顯差異(P>0.05)；首免后21 d，芪黃素對照組抗體效價最高，顯著高于除24 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)；首免后28 d，各給藥組與免疫對照組及給藥組間均無明顯差異(P>0.05)(圖5)。

2.3 桑葉粗多糖對氣管黏膜sIgA分泌的影響

由表1可知，7 d桑葉粗多糖各組氣管洗液中sIgA濃度高于免疫對照、空白對照組，但差異不明顯(P>0.05)。14、21 d桑葉粗多糖高、中劑量組氣管洗液中sIgA濃度高于其余各組，與免疫對照組和空白對照組差異顯著(P<0.05)。28 d 桑葉粗多糖高、中劑量組和芪黃素對照組氣管洗液中sIgA濃度顯著高于其余各組(P<0.05)。

2.4 桑葉粗多糖對空腸黏膜sIgA分泌的影響

由表2可知，7 d桑葉粗多糖各組空腸洗液中sIgA濃度顯著高于芪黃素對照、免疫對照、空白對照組(P<0.05)。14 d 桑葉粗多糖中劑量組空腸洗液中sIgA濃度顯著高于除高、低劑量組外的其余各組(P<0.05)。21 d桑葉粗多糖3個劑量組空腸洗液中sIgA濃度顯著高于除芪黃素對照組外的其余各組(P<0.05)。28 d桑葉粗多糖各組和芪黃素對照組氣管洗液中sIgA濃度顯著高于免疫對照和空白對照組(P<0.05)，但桑葉粗多糖各組間無明顯差異(P>0.05)。

表1 各組氣管洗液中sIgA含量(n=6)

注：同列數據后不相同字母者差異顯著(P<0.05)。下表同。

表2 各組空腸洗液中sIgA含量(n=6)

3 討論

3.1 不同中藥提取物對新城疫血清抗體水平的影響

動物機體的體液免疫應答是由B淋巴細胞介導的，通過對抗原的識別、活化、增殖，后分化為漿細胞并分泌抗體[11]。體液免疫應答是清除細胞外病原體最重要的途徑[12]，因此血清特異性抗體水平的高低可作為評估機體體液免疫功能的重要指標之一[13]。

中藥提取物由原材料或飲片應用科學的方法進行提取、分離、純化制得，以更明確有效的成分、穩定可控的質量、治療疾病的有效性等優勢被廣泛研究[14-15]。如黃芪多糖、淫羊藿多糖、峰膠黃酮、人參皂苷等中藥成分可顯著促進雞外周血淋巴細胞轉化，提高血清ND抗體效價[16]；中藥九節茶可以改善應激負荷小鼠淋巴細胞數目及淋巴細胞亞群比例[17]。中藥提取物對免疫細胞的刺激作用及對血清特異性抗體產生水平的影響常作為評價其是否具有免疫增強或免疫抑制作用的指標。

本研究比較桑葉、杜仲、杜仲葉不同提取物在不同給藥劑量下對ND疫苗血清特異性抗體水平的影響。雞在免疫ND疫苗前3 d，每日給以不同中藥提取物(以總多糖計)，連用 7 d。結果顯示，桑葉水提物組在首免后的7、14、21、28 d，12 mg 組抗體效價在大部分時間點優于其他各組；同法給藥，桑葉粗多糖組在首免后的各時間點，4 mg組抗體效價優于其他各組；杜仲水提物組2 mg組抗體效價在多個時間點優于其他各組；杜仲葉水提物組4 mg組抗體效價在多個時間點優于其他各組；杜仲葉多糖組在不同給藥劑量下，12 mg組稍優于其他各給藥組，桑葉粗多糖在4 mg給藥劑量下，在首免后7、21、28 d抗體效價均優于其他各組，在首免后14 d抗體效價與芪黃素對照組相似。因此，可以初步確定雞每次免疫ND疫苗前3 d，以4 mg/羽給桑葉粗多糖(以總多糖計)，連用 7 d，可顯著提高血清ND特異性抗體水平。

3.2 桑葉粗多糖對雞呼吸道和腸道黏膜免疫水平的影響

呼吸道是空氣進入機體的通道，時刻受到各種微生物及非己物質的刺激。呼吸道黏膜免疫系統是呼吸道抵抗外來病原體入侵的重要防線[18]。呼吸道組織中大量的免疫細胞均參與介導黏膜固有免疫應答和適應性免疫應答，合成和分泌大量的分泌型免疫球蛋白(如sIgA)和細胞因子，在抵抗病原體感染和黏膜疫苗免疫中發揮重要的調節作用[19]。

各組氣管洗液中sIgA濃度隨著時間的增加逐漸降低。在首免后14～28 d，桑葉粗多糖高、中劑量組氣管洗液中sIgA的濃度均顯著高于免疫對照和空白對照，稍優于桑葉粗多糖低劑量組和芪黃素對照組。表明雞以8、4 mg/羽給桑葉粗多糖(以總多糖計)，可有效提高氣管中IgA分泌量，提升呼吸道黏膜免疫水平。

腸道是機體最大的免疫器官[20]。腸黏膜產生的分泌型IgA(sIgA)，在黏膜表面提供了多種保護性功能[21]，能減少黏膜表面許多微生物的定居[22]，有效地中和病毒和腸腔中產生的細菌毒素[23]，并可選擇地轉移到其他黏膜組織中，從而為防止病原微生物入侵建立了廣泛而穩固的黏膜屏障體系[24-25]。

本試驗空腸洗液中sIgA含量的測定結果顯示，各組空腸洗液中sIgA濃度也隨著時間的增加逐漸降低。在免疫初期，桑葉粗多糖各組sIgA含量均顯著高于芪黃素對照和VC、BC組。表明使用桑葉粗多糖在免疫初期能提高腸道sIgA水平，產生較好的免疫保護。在其他大部分時間點，桑葉粗多糖各組的sIgA含量均顯著高于VC和BC組，稍優于芪黃素對照或與之相似，表明桑葉粗多糖能顯著促進小腸sIgA的分泌，從而增強小腸的黏膜免疫功能。

綜上所述，雞每次免疫ND疫苗前3 d，以4 mg/羽給桑葉粗多糖(以總多糖計)，連用7 d，可顯著提高血清ND特異性抗體水平，提高氣管和小腸中sIgA分泌量，增強呼吸道和小腸的黏膜免疫功能。