獺兔CREB1基因的編碼區克隆、生物信息學及表達規律分析

陳 陽， 秦立志， 趙博昊， 胡帥帥， 穆 琳， 翁巧琴， 鮑國連， 吳信生

(1.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009； 2.浙江省余姚市欣農兔業有限公司，浙江余姚 315400；3.浙江省農業科學院，浙江杭州 310021)

獺兔，即力克斯兔(Rex rabbit)，是皮用型兔的代表之一，其被毛顏色豐富多樣，且純天然的被毛不掉色或褪色，深受消費者青睞。目前，美國認可的獺兔毛色有14種，歐洲認可的有30種，我國以青紫藍色、黑色、海貍色、白色為主。一般而言，動物的毛色與皮膚中黑色素的數量和分布密切相關，同時許多內在因子也影響著毛色性狀的表現[1]。哺乳動物毛色主要取決于黑色素沉積，黑色素細胞產生真黑素和棕黑素，二者分布的不同致使哺乳動物形成多種毛色類型[2-3]。筆者所在課題組前期利用表達譜芯片篩選與獺兔毛色形成相關的基因，發現CREB1基因在不同毛色的獺兔皮膚中表達差異顯著，表明該基因可能參與到獺兔的毛色形成過程中[4]。

環腺苷酸反應元件結合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)屬于DNA蛋白結合類亮氨酸拉鏈結構轉錄因子超家族，主要與cAMP等信號發生應答反應[5]。由于mRNA具有穩定性調節和翻譯后修飾的調控作用，機體細胞內存在多種CREB基因的剪接方式，可以產生不同的剪接體，CREB1即為該家族中常見成員之一[6-7]。已有文獻報道，磷酸化CREB可以激活下游轉錄因子MITF，已知MITF是主控調節黑素細胞的發展、功能和生存的基因，可激活酪氨酸酶基因的轉錄[8-10]。基于此，本研究通過分子克隆等技術手段，獲得了獺兔CREB1基因的編碼區序列(coding sequence，CDS)，并利用熒光定量手段檢測其在不同獺兔皮膚中的表達規律，為進一步探究CREB1基因的功能及毛色形成機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 選取成年青紫藍色獺兔、白色獺兔和黑色獺兔各3只，耳緣靜脈注射空氣處死，取約1 cm2相同位置的背部皮膚組織，-70 ℃保存。

1.1.2 試驗試劑 Gel Extraction Kit、DNA marker、dNTPs、TaqDNA聚合酶、反轉錄試劑盒、限制性內切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ、大腸桿菌感受態細胞DH5α、pMD19-T Simple Vector購于寶生物工程(大連)有限公司；Trizol試劑、質粒提取試劑盒、SYBR?Green Master Mix試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與檢測 采用Trizol法提取總RNA，通過1%變性瓊脂糖凝膠和NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀，檢測總RNA的完整性、濃度和D260 nm/D280 nm。

1.2.2 引物設計 根據GenBank數據庫中提供的CREB1基因CDS序列(XM_002712603)設計特異性克隆引物，并分別在上下游引物中引入Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切位點，同時設計兔CREB1、GAPDH基因實時熒光定量PCR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

1.2.3CREB1基因的克隆 將總RNA進行反轉錄反應，利用CREB1基因特異性引物擴增編碼區序列。50 μL PCR反應體系：ddH2O 33.5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP 5 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL，模版2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性35 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。構建pMD19-T-CREB1克隆質粒，用Hind Ⅲ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，選取陽性質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 CREB1基因克隆引物序列

注：限制性內切酶位點即序列中下劃線的部分。

1.2.4 生物信息學分析 進行氨基酸序列同源性比對，利用軟件MEGA 5.1構建系統進化樹；蛋白質組成及疏水性分析：http：//cn.expasy.org/tools/protparam.html/；蛋白質信號肽預測：http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；蛋白質跨膜區預測：http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/；蛋白質亞細胞定位分析：http：//psort.hgc.jp/form2.html/；用Hopfield神經網絡預測CREB1蛋白的二級結構(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)；用swiss-model(http：//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php)預測CREB1蛋白的三級結構。

1.2.5 實時熒光定量PCR 根據熒光定量試劑盒說明書，分別對青紫藍色、白色和黑色獺兔總RNA通過反轉錄反應，進行qRT-PCR試驗。20 μL反應體系：AceQTMqPCR SYBR?Green Master Mix 10 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，ROX Reference Dye 2 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，滅菌蒸餾水6.8 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火30 s，40個循環。融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以白色獺兔為對照組，以GAPDH基因為內參基因，采用2-ΔΔCT法計算CREB1基因的相對表達量，利用SPSS 22.0統計軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 獺兔CREB1基因編碼區的克隆

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獺兔背部皮膚總RNA，顯示28S、18S和5S 3條帶，說明RNA完整性較好。用NanoDrop 2000檢測發現，總RNA無DNA和蛋白質污染，符合RT-PCR要求。利用CREB1基因特異性引物進行擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，其產物大小與預期(984 bp)相符，且條帶清晰、特異性好(圖1-A)。

利用TA克隆原理，將CREB1基因連接至pMD19-T Simple載體上，獲得克隆質粒pMD19-T-CREB1，并采用限制性內切酶Hind Ⅲ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，結果顯示大小約2 600、1 000 bp的2條帶(圖1-B)，與預期結果(2 692、984 bp)相符，說明CREB1基因克隆成功。

2.2 獺兔CREB1基因的序列分析

經比對，克隆序列與NCBI(美國國立生物技術信息中心)已知序列相似度為99.6%，將克隆序列提交至GenBank(登錄號為KJ139984)。CREB1基因CDS含984個核苷酸(51.63% A+T，48.37% C+G)，共編碼327個氨基酸，相對分子量約為35.05 ku。利用ExPASy中的工具ProtParam分析得出，CREB1蛋白等電點為5.30，不穩定性系數為61.13，為不穩定性蛋白；CREB1蛋白預測GRAVY值為-0.443，為親水蛋白。通過SignalP 4.0和TMHMM預測發現，該蛋白無信號肽、無跨膜區，亞細胞預測顯示該蛋白主要定位于細胞核(表2)，推測該蛋白為核內可溶性蛋白。

用Hopfield神經網絡和Swiss-model分別對CREB1蛋白的二級結構和三級結構進行預測。結果如圖2所示，CREB1蛋白二級結構中含有33.33%α螺旋(h)，44.95%無規卷曲(c)，21.71%延伸鏈(e)；三級結構為1條螺旋鏈。

表2 CREB1蛋白質的亞細胞定位分析

2.3 獺兔CREB1蛋白與其他物種的同源性比較及系統進化分析

將克隆測序得到的獺兔CREB1基因CDS與人(Homosapiens)、牛(BosTaurus)、豬(Susscrofa)、雞(Gallusgallus)、小鼠(Musmusculus)、獼猴(Macacamulatta)、猩猩(Pongoabelii)、大鼠(Rattusnorvegicus)、斑胸草雀(Taeniopygiaguttata)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)進行同源性比較發現，獺兔CREB1基因氨基酸序列與人、豬等哺乳動物的同源性較高，為92.9%～95.4%，而與其他非哺乳動物(雞、斑胸草雀等)的同源性較低。利用MEGA 5.1軟件構建鄰接法(NJ)系統進化樹，發現兔與人、猩猩、獼猴聚為1支，系統進化情況基本上與其親緣關系遠近一致，結果如圖3所示。

2.4 CREB1基因在不同毛色獺兔皮膚中的表達分析

通過qRT-PCR檢測黑色、白色和青紫藍色獺兔皮膚組織中CREB1基因mRNA的表達水平，結果發現，CREB1基因在黑色獺兔和青紫藍色獺兔中的表達量均極顯著高于白色獺兔(P<0.01)，且在黑色獺兔中的表達量最高(圖4)。

3 討論

cAMP反應元件(cAMP response element，CRE)是指基因啟動子中的一段特定的DNA序列5′-TGACGTCA-3′[11]。CREB(環磷腺苷效應元件結合蛋白)是PKA(蛋白激酶A)、MAPK(絲裂原激活的蛋白激酶)、PKC(蛋白激酶C)、CaMKs(鈣調蛋白激酶)等多種蛋白激酶的磷酸化底物，這些蛋白激酶可將CREB蛋白KID(激酶誘導區)的Ser(絲氨酸)-133位點磷酸化，從而影響CREB的活性[12-15]。已知，cAMP-PKA信號通路介導的磷酸化反應在黑色素生成過程中發揮了重要作用，CREB則是活化的PKA的主要靶標蛋白，磷酸化后CREB激活MITF的轉錄，促使MITF與TYR基因啟動子Mbox結合，從而激活TYR的表達，促進黑色素生成。反之，降低CREB的磷酸化水平，MITF和酪氨酸酶也會受到一定的抑制[16]。在筆者所在課題組前期研究中，通過高通量技術手段發現CREB1基因與獺兔的毛色形成有關，與已有報道相符。

在本研究中，筆者發現獺兔CREB1基因的氨基酸序列與NCBI中其他哺乳動物具有很高的同源性，即CREB1基因在哺乳動物中非常保守，那么CREB1基因在獺兔毛色形成中是否具有同樣的功能呢？已有報道指出，CREB1基因可調控MC1R基因與MITF基因之間色素沉著信號的傳遞，進而影響黑色素的沉積[17]。通過對黑色素生成信號通路的進一步研究發現，MC1R對CREB1有激活作用，增強MITF基因的表達，活化了與黑色素形成密切相關的基因，如TYR、TYRP1和KIT，所以CREB1在黑色皮膚中的表達量較高[18]。本研究中獺兔CREB1基因在黑色獺兔和青紫藍色獺兔皮膚中表達水平高于白色獺兔，也印證了其他學者的觀點，CREB1基因對黑色素的形成有明顯的促進作用。

本研究利用分子克隆手段獲得獺兔CREB1基因的編碼區序列，通過生物信息學預測發現，該蛋白為無信號肽、無跨膜區的核內可溶性蛋白，且在哺乳動物中非常保守。同時發現，CREB1基因的表達量與毛色的黑色素沉積存在一定的關聯性，本研究為探索獺兔毛色形成機制提供了一定的基礎資料。