腸炎型犬細小病毒的分離鑒定及病毒滴度測定

吳 雙， 朱善元， 郭長明， 秦 楓， 左偉勇， 王永娟， 洪偉鳴， 王安平

(江蘇農牧科技職業學院/江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇泰州 225300)

犬細小病毒(CPV)感染是以嘔吐和腹瀉并伴有胃腸道出血等為主要病征的急性傳染性疾病，加拿大、美國和澳大利亞同年報道從患腸炎的病犬糞便中分離到CPV，該病很快在全世界范圍內傳播。各年齡段犬均可發病，以6月齡以下幼犬發病和死亡較多[1]。作為細小病毒中最易變異的病毒[2]，1980年報道，1978—2000年從最初的CPV-2型演變出現了CPV-2a，與CPV-2相比潛伏期更短、腸炎癥狀更嚴重、糞便中病毒含量低；1984年報道了CPV-2b，2000年報道了CPV-2c，2010年在國內首次被鑒定，致病性更強，3種抗原變異株。近10年來，世界各地出現了New CPV-2a、New CPV-2b和New CPV-2c優勢抗原變異株，其中New CPV-2a/b主要在中國、韓國和日本等亞洲國家流行。New CPV-2a/b與CPV-2a/b區別在于VP2蛋白上297位氨基酸發生了突變，改變了與宿主細胞受體的親和力[3-4]。CPV-2的變異主要是通過VP2基因定向漂移產生新抗原變異株[5]，只是在VP2蛋白上5～8個關鍵氨基酸位點發生了變化，但卻導致抗原性、致病性和宿主譜發生改變[6]。CPV-2是一種無囊膜、單股負鏈的易變異DNA病毒，基因組約為5 200個核苷酸，編碼的結構蛋白包括VP1和VP2，其中VP2 是病毒結構蛋白，含有CPV的主要抗原決定簇，約占病毒衣殼蛋白90%的比重。VP2蛋白在決定病毒的宿主范圍、結合及進入細胞過程中均起到了重要作用[7-8]。由于CPV-2的復制和組裝須要借助宿主細胞中的多種DNA復制酶，因此只能在分裂間期細胞中復制，所以采用同步接毒法來分離病毒[9]。本試驗采用同步接毒法利用F81和MDCK細胞分離到1株CPV，該病毒屬于CPV-2a亞型，為了滿足后續測定重組犬干擾素活性試驗的需要，測定了該分離株的病毒滴度。

1 材料與方法

1.1 疑似犬細小病毒病病料的采集

江蘇省泰州某寵物醫院收治了3例疑患犬細小病毒病的病犬，病犬均出現典型的腹瀉癥狀、嘔吐、消瘦、鼻鏡干燥等臨床癥狀，采集病犬的新鮮糞便，先按照韓國安捷公司生產的CPV膠體金快速診斷試紙說明書進行檢測，后采集檢測為陽性犬的新鮮糞便，將其置于含3%胎牛血清、10%雙抗的RPMI-1640，于-80 ℃下備用。

1.2 細胞、常用試劑

F81和MDCK購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清、DMEM培養基、胰酶、青鏈雙抗，購自GIBCO公司；安捷快速檢測CPV抗體試劑盒、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5αCompetent Cells、Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?試劑盒、DNA marker、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 犬細小病料處理

病料反復凍融3次后擠凈棉簽，5 000 r/min×10 min離心后的上清經0.22 μm過濾至滅菌凍存管中。在F81細胞消化傳代的同時將代接種的病料上清按照1 ∶10接種細胞培養液比例采用同步接毒法傳代，于37 ℃、5% CO2培養24 h，再換2% DMEM維持液繼續培養，同時設正常細胞對照。若有80%細胞出現細胞病變(CPE)時，收獲病毒；按照1 ∶30比例進行傳代。如果沒有出現CPE則于4～5 d收取上清，細胞傳代至第3代仍無CPE，則判斷為陰性。同時，利用MDCK細胞按照上述方法進行病毒分離。

1.4 DNA的提取、VP2基因片段測序及分析

參考GenBank發布的CPV基因，設計1對引物[CPV-VP2-U，5′-AGAGACAATCTTGCACCAAT-3′；CPV-VP2-D1755，5′-TATAATTTTCTAGGTGCTAGTTG-3′引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成]。

按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑使用說明書流程提取陽性病料中病毒基因組DNA，將DNA模板置于-80 ℃備用。運用高保真酶PrimeSTAR? HS DNA聚合酶擴增VP2基因，PCR反應條件為：98 ℃10 s；60 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，30個循環。利用Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?試劑盒連接膠回收目的片段，轉化后挑取白色菌落，將菌落PCR方法鑒定為陽性的菌液送至英濰捷基(上海)貿易有限公司測序，至少送3個陽性克隆測序。應用 Lasergene軟件對VP2基因核苷酸序列進行同源性分析，應用MEGA5.03采用Maximum Likelihood法(最大似然法)構建系統進化樹進行分析。

1.5 病毒滴度的測定

將培養的病毒液反復凍融3次后，用2% DMEM維持液做10倍比稀釋，取10-1～10-7稀釋度接種MDCK細胞。將MDCK細胞消化稀釋為2×105個/mL后鋪布于96孔細胞板，每孔加100 μL細胞懸液，再將稀釋好的病毒液接種于孔中，每孔100 μL，每個稀釋度重復10孔。每個稀釋度做2個陰性對照孔，每孔加入100 μL維持液，37 ℃培養72 h，鏡檢，觀察細胞形態并記錄病變孔的數目，通過組織細胞半數感染量(TCID50)計算病毒滴度，按Reed-Muench法計算結果。

2 結果與分析

2.1 CPV細胞分離結果

按同步接毒法接種F81細胞，僅病料3從第2代次開始出現細胞病變(CPE)，細胞發生變圓、拉網狀、脫落、崩解等形態變化，將分離到的病毒命名為CPV-F。細胞在接毒72 h出現明顯的細胞病變(圖1-A)，對照組細胞生長正常(圖1-B)；其他2份病料傳至第3代仍無CPE，判斷為陰性。

采用上述的同步接毒法接種MDCK細胞后僅病料3從第3代次出現CPE，命名為CPV-M。從圖2可以看出，在MDCK細胞培養72 h時出現的細胞病變。

2.2 PCR擴增及其序列分析

通過PCR方法擴增得到的片段與預期片段大小一致，3份病料均擴增到目的片段，1、2、3泳道依次命名為CPV1、CPV2、CPV3。從圖3可以看出，3份病料中病毒含量差異明顯。

經切膠回收TA克隆后僅CPV3測序成功。根據VP2基因核苷酸序列的測序結果繪制系統進化樹，CPV3位于2a分支中，基因核苷酸序列系統發生樹見圖4。

將測序獲得的CPVVP2基因及推導氨基酸序列進行分析，該分離株的426位為天冬酰胺，符合CPV-2a亞型的特征。與上述引用的21株VP2基因的同源性為99.2%～99.9%，氨基酸同源性亦為99.2%～99.9%。系統發生樹表明CPV3與上海分離株CPV/CN/SH1/2013(KR002792)親緣關系最近。

2.3 病毒滴度的測定結果

在加入病毒72 h時通過記錄MDCK病變孔的數目，運用Reed-Muench法計算TCID50數值，其中CPV-M-5的TCID50數值為10-4.83/0.1 mL，CPV-M-10的TCID50數值為10-5.50/0.1 mL。

3 討論與結論

本試驗從疑似感染犬細小病毒病的糞便中分離到1株病毒，經2種細胞培養和分子生物學的鑒定獲得CPV3，該病毒屬于CPV-2a亞型，測定了2個代次的病毒滴度，為后續測定重組犬干擾素活性提供了基礎材料。

CPV由于自身所帶基因限制，其復制增殖病毒前期所需的酶均要宿主細胞提供，要求宿主細胞必須處于對數生長期，故細小病毒培養分離多采用同步接毒方法[10]。相關文獻報道，分離CPV常用細胞有F81和MDCK，由于F81細胞出現CPE更加明顯，所以成為分離CPV最常用的培養細胞。本試驗中CPV感染的F81和MDCK細胞均出現CPE，雖然F81出現CPE時間更早、癥狀更明顯，但是MDCK中CPE癥狀也是很容易觀察到，這些細胞病變情況與相關報道較一致。

本試驗中應用膠體金試紙條和PCR檢測技術結果相一致，3份病料均檢測到含有CPV，但在細胞分離病毒的過程中，只有病料3分離到CPV。結果表明，膠體金試紙條和PCR檢測靈敏度遠高于病毒分離，而分離到病毒的難度要高于檢測到病毒。本研究中擴增的VP2基因全長為1 755個核苷酸，共編碼584個氨基酸。該病毒與CPV-2的VP2基因推導的氨基酸相比，共有Met87Leu、Ile101Thr、Ala300Gly、Asp305Tyr、Val555Ile 5個氨基酸序列發生了突變，據此判定CPV3屬于CPV-2a亞型。分析VP2基因序列發現，CPV3位于遺傳進化樹的2a分支中，且與國內分離株的親緣關系普遍較近，該遺傳進化樹一定程度上表明國內分離的CPV沒有明顯的地域差異。

為了后續試驗的需要，對分離CPV-M進行傳代增殖并測定TCID50數值，CPV-M-5的TCID50數值略低于CPV-M-10的TCID50數值，表明毒株的毒力在傳代中逐漸增強。傳代導致毒力增強的原因還有待于進一步研究闡明。