疏水性農藥對費氏弧菌毒性的微板發光測定法研究

陽辛鳳， 葛會林， 李萍萍， 張 群， 劉春華

(中國熱帶農業科學院分析測試中心/農業部熱帶農產品質量監督檢驗測試中心(?？?/海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室，海南?？?571101)

農產品農藥殘留引起的質量安全問題是國內外普遍關注的焦點，儀器分析是對農產品農藥殘留進行檢測的重要手段。然而，儀器分析常常是對一定范圍內的特定農藥進行檢測，在殘留農藥不明確的情況下，發光菌檢測法(luminescence bacteria test，簡稱LBT)以其快速、簡單和可進行綜合毒性評價而比儀器分析更具優勢。發光細菌(luminescence bacteria)是一類能在生長過程中發出450～490 nm可見熒光的非致病性革蘭氏陰性菌，發光菌法是通過發光菌與有毒物直接接觸而引起發光值發生變化的直接生物毒性測試方法[1]。該方法最初被應用于飲用水安全評價，例如，國際標準組織(international organization for standardization，簡稱ISO)頒布了ISO 11348-3—2007《水質水樣對弧菌類光發射抑制影響的測定(發光細菌試驗)》[2]，我國頒布了應用發光菌明亮發光桿菌進行水質毒性測試的國家標準GB/T 15441—1995《水質急性毒性的測定 發光細菌法》[3]。LBT還可應用于水質狀況評價[4-5]、環境污染毒性評價和檢測[6]、重金屬毒性評價[7]、農產品農藥獸藥殘留檢測[8-10]、食品中食品添加劑檢測[11-12]和農產品生物毒素檢測[13]等。利用發光細菌對農產品中農藥、獸藥、抗生素等污染物進行風險評估是目前農產品質量安全研究領域新熱點，與儀器分析相比，LBT具有操作簡單、快速、靈敏和成本低等優點，在農產品農藥殘留快速檢測中有著廣泛應用的前景，對農產品質量安全具有指導意義。

在農產品質量安全風險評估領域，目前LBT多用于親水性農藥的檢測，如敵百蟲、樂果、乙酰甲胺磷、抗蚜威、甲霜靈等[10，14]。發光菌菌懸液是以水為連續相的混合體系，親水性農藥溶液與菌懸液混合后，農藥通過與發光菌直接接觸抑制發光。然而，在農業生產中常用農藥多數是疏水性的，在建立LBT方法時，以水為溶劑配制疏水性農藥溶液時須要添加助溶劑，常用的是二甲基亞砜(DMSO)[14-15]。楊潔等以1%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)為助溶劑溶解疏水性農藥莎稗磷、高效氯氰菊酯、氰戊菊酯時得到的溶液呈乳濁液狀態[14]。這表明疏水性農藥在1% DMSO溶液中溶解性差，由此可能造成LBT結果與真實毒性有差異。本研究發現，以1% DMSO為溶劑時，多菌靈等疏水性農藥溶解性很弱，濃度越高，溶液越渾濁，伴有沉淀析出，在1～500 μg/mL的寬廣濃度范圍，費氏弧菌與疏水性農藥作用后其發光抑制率變化幅度小，不能獲得發光抑制率在0～100%范圍的劑 量- 效應曲線(dose-response curve，簡稱DRC)；而以甲醇為溶劑時，可以在較窄的濃度范圍獲得發光抑制率在0～100%范圍的DRC。以甲醇作為疏水性農藥的溶劑進行LBT測定目前未見報道，甲醇在眾多有機溶劑中對發光菌的毒性是最小的[16-17]，而且對農藥溶解性能極佳，是潛在的可用于LBT的溶劑。

本研究旨在通過分析以甲醇為溶劑時疏水性農藥對費氏弧菌發光的抑制效應，探索疏水性農藥影響費氏弧菌發光的規律，為初步建立利用發光細菌快速檢測農產品中疏水性農藥殘留的方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Synergy 2多功能微孔板檢測儀(美國Bio-Tek)、HVE-50全自動高壓滅菌鍋(日本Hirayama)、Milli-Q?超純水系統(美國Millipore公司)、QYC-2012C 全溫培養搖床(上海福馬實驗設備有限公司)、Eppendorf移液器(德國Eppendorf)、96微孔板(美國Corning)。

標準品多菌靈、溴氰菊酯、毒死蜱(純度均為98.5%)均購自德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈均為色譜純(美國Fisher)；Difco海生菌肉湯2216購自美國BD公司。

1.2 試驗菌種

菌種為1H00021費氏弧菌(Vibriofisheri)，購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心。

費氏弧菌液體培養基：稱取2216海生菌肉湯粉末 37.4 g，加水1.0 L，加熱攪拌使充分溶解，分裝至三角瓶，121 ℃ 條件下高壓滅菌20 min。

費氏弧菌的搖瓶培養：挑取1環費氏弧菌斜面培養物，接入海生菌肉湯2216液體培養基中，于22 ℃、120 r/min條件下搖瓶培養16 h。培養好的菌液在暗室內以肉眼可見明亮的熒光，取100 μL菌液于96微孔板中，放入多功能微孔板檢測儀上檢測，菌液發光值(relative light unit，簡稱RLU)不低于100萬光子數。

1.3 農藥對發光菌毒性的測定

多菌靈、溴氰菊酯、毒死蜱分別溶解于甲醇中，再以甲醇進行稀釋，配制得到系列濃度的溶液，通過預備試驗獲得適宜的濃度范圍，確保系列濃度的農藥溶液對費氏弧菌1H00021的發光抑制率在0～100%之間均勻分布。

3種疏水性農藥對費氏弧菌發光毒性作用體系總體積為200 μL。移取系列濃度的農藥溶液各30 μL，分別加入到96微孔板中(第1橫排)，以同體積甲醇為空白對照，每個濃度重復3次(即第2、第3橫排為第1橫排的重復)，最后加入 170 μL 費氏弧菌1H00021菌懸液，立即將96微孔板放入多功能微孔板檢測儀，振板5 min，測定毒物與發光菌作用 20 min 時的發光強度。

采用空白樣品發光強度平均值I0與農藥各濃度樣品對應的發光強度平均值I計算對費氏弧菌的毒性，以發光抑制率E表示[8]：E=(1-I/I0)×100%。

1.4 劑量-效應曲線(DRC)模擬

采用Origin 8.5統計軟件進行數據處理和統計分析，擬合劑量-效應曲線，根據擬合模型利用Origin 8.5 “From Y to X”功能計算得到農藥與費氏弧菌1H00021作用20 min時的半效應濃度(EC50)，并以此判斷農藥對費氏弧菌1H00021毒性的大小。

2 結果與分析

2.1 甲醇對費氏弧菌的發光毒性

LBT毒性測定時，低濃度二甲基亞砜水溶液(DMSO≤1%)常被用于溶解疏水性農藥，如阿維菌素等[14]。但在本試驗中發現，多菌靈等3種目標農藥在1% DMSO水溶液中均有顆粒析出現象，因此未采用1% DMSO作為本試驗的溶劑。甲醇對農藥溶解性能極佳，而且有研究表明[16-17]，常用有機溶劑中，乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、四氫呋喃、異丙醇等7種有機溶劑對淡水發光菌青?；【鶴67均有抑制毒性，其中甲醇毒性最小，因此甲醇是潛在的可用于LBT的溶劑，但甲醇對費氏弧菌毒性尚未見報道。本研究測定甲醇對費氏弧菌發光強度的影響(圖1)，結果表明，LBT檢測體系中隨著甲醇濃度的增加，費氏弧菌的發光強度減弱。甲醇為親核試劑，具有負電性，是氫鍵的接受體，當發光細菌接觸到甲醇時，甲醇能與發光菌體細胞內的黃素單核苷酸發生氫鍵鍵合，從而阻礙氫的傳遞，進而抑制發光菌的發光[16]。

2.2 疏水性農藥對費氏弧菌發光毒性檢測體系的建立

毒物進入發光菌生長環境中后，通過直接抑制細菌發光反應過程的酶活性，或是抑制細菌胞內發光反應相關的代謝反應進而抑制發光強度。本試驗設置LBT體系總體積為 200 μL 及作用于費氏弧菌時間為20 min，通過測定不同體積比的農藥溶液作用于費氏弧菌的發光毒性，確定檢測體系中疏水性農藥溶液與費氏弧菌菌懸液的適宜體積比(圖2)；通過測定不同濃度農藥溶液與費氏弧菌接觸時間在5、10、15、20、25、30 min下的發光抑制率，確定幾種疏水性農藥與費氏弧菌接觸反應的適宜時間(圖3)。

由圖2可知，檢測體系總體積為200 μL及作用時間為 20 min 時，在疏水性農藥溶液與費氏弧菌菌懸液的體積比分別為10/190、25/175、30/170、40/160這4種不同比例下(甲醇比例依次增加)，各稀釋度的多菌靈溶液(0.2～100.0 μg/mL)對費氏弧菌1H00021的發光抑制強度有明顯區別?？傮w來說，4種比例下費氏弧菌1H00021的發光值均隨著多菌靈濃度的增加而下降；隨檢測體系甲醇比例的增加，費氏弧菌發光值降低。比例為10/190費氏弧菌的發光值最高，但發光值曲線較為平直，即使多菌靈濃度大幅度升高，發光值也僅有微弱下降；發光值最高的原因可能是體系中甲醇比例最低(5%)，對發光抑制作用弱；發光值曲線變化較為平緩，原因可能是對費氏弧菌產生發光毒性抑制的僅僅是溶解狀態的多菌靈，當水相比例較高，超過一定比例時，多菌靈會沉淀析出，析出的這部分多菌靈對費氏弧菌發光無抑制作用。比例為40/160時，費氏弧菌發光值最低，發光值曲線亦較為平直，原因可能是體系中甲醇濃度過高(20%)，甲醇對費氏弧菌產生了強烈抑制。比例為30/170時，費氏弧菌發光值較高，且介于10/190和40/160之間，發光值曲線具有較適宜的斜率，表現為隨著多菌靈濃度的升高，發光值也相應降低；發光值較高的原因可能是盡管體系中甲醇達到了15%，但由于費氏弧菌初始發光值高，以及15%甲醇對費氏弧菌發光作用影響有限，故發光值仍然較高；發光值曲線具有較適宜的斜率，原因可能是在30/170的比例下，多菌靈保持了良好的溶解，溶解狀態的多菌靈均能充分地與費氏弧菌接觸，抑制其發光?？梢姡w積比30/170是一個平衡點，既不會大幅度抑制費氏弧菌的發光作用，又能兼顧疏水性農藥的良好溶解性及毒性，因而農藥濃度與發光率之間有良好的相關性。袁東星等認為，即使農藥濃度與發光強度的相關性不呈嚴格的線性關系，在農藥殘留的實際檢測中仍具有實際意義。因為現場快速檢測經常要求半定量即可[18]。圖2的曲線完全符合這一要求。綜合上述結果，以30/170作為疏水性農藥LBT方法中農藥溶液與費氏弧菌菌懸液的體積比。

圖3-a至圖3-c分別為多菌靈、溴氰菊酯、毒死蜱與費氏菌接觸時間為5～30 min的發光抑制作用曲線?？傮w來說，費氏弧菌1H00021的相對發光強度隨作用時間的延長而下降，多菌靈、溴氰菊酯和毒死蜱與費氏弧菌接觸時間為10、15、20、25、30 min的發光抑制作用曲線接近，且略高于接觸時間5 min時的發光抑制作用曲線。鑒于不同毒性物質對費氏弧菌發光產生影響的速度不同，本研究以作用20 min時的測定值作為定量研究的數據。

綜合以上結果，建立疏水性農藥對費氏弧菌1H00021短期微板發光毒性測定方法。疏水性農藥溶解于甲醇中，每個微孔的毒性測定體系為200 μL，包括30 μL農藥溶液，170 μL費氏弧菌菌懸液，最佳檢測時間為20 min。

2.3 3種疏水性農藥對費氏弧菌的發光毒性

對發光菌毒性研究表明，在一定質量濃度范圍內，農藥的質量濃度與發光細菌的發光強度變化呈函數關系，可據此擬合劑量-效應曲線(DRC)對農藥進行定量或半定量。本研究應用Origin 8.5線性擬合功能和非線性擬合功能擬合3種農藥對費氏弧菌1H00021的劑量-效應關系，擬合模型及相關參數見圖4、表1。線性擬合時，毒死蜱相關系數最低，為0.842 8。非線性擬合時，3種疏水性農藥擬合模型的相關系數r均大于0.97，DRC都可用Log3P1函數有效表征。因此，雖然線性擬合函數和Log3P1函數都能較好地描述脂溶性農藥對費氏弧菌的發光毒性，但Log3P1函數優于線性擬合函數。

利用Origin8.5的“從y至x”功能可計算各個效應下的濃度，如半數抑制濃度EC50等。EC50是農藥毒性大小的表征。由表1可知，無論是線性擬合函數，還是Log3P1函數，3種脂溶性農藥對費氏弧菌毒性大小順序均為多菌靈>溴氰菊酯>毒死蜱。然而，由于擬合函數的差異，當函數的相關系數高時，由線性擬合和Log3P1函數計算得到的EC50相同或接近，如多菌靈EC50均為0.024 μg/mL。然而，隨著相關系數降低，相關性逐漸減弱，由線性擬合和Log3P1函數計算得到的EC50的差異逐漸增大，如溴氰菊酯、毒死蜱。

有毒物質對發光細菌發光的抑制，主要源于對發光反應核心熒光素酶活性的抑制，其遵循酶活性抑制動力學原理，因此以毒物濃度對發光抑制率作線性回歸方程不一定是最適合的[19]。本試驗同樣表明線性擬合的局限性如多菌靈，線性擬合與非線性擬合結果是一致的，但對于溴氰菊酯和毒死蜱，非線性擬合得到的函數具有更好的相關性。

3種疏水性農藥對費氏弧菌的發光抑制率隨污染物濃度的增加而逐漸增大。與溴氰菊酯、毒死蜱相比，多菌靈對費氏弧菌的EC50最小，毒性效應最強，這可能是因為多菌靈屬于殺菌劑，而溴氰菊酯和毒死蜱屬于殺蟲劑，費氏弧菌對殺菌劑毒性更為敏感。

已報道的毒物DRC具有多種形狀，主要類型有線性[14]、S形[8，16，20]和J形[16]等。郭柔杉等采用費氏弧菌評價果汁中亞硝酸鈉、食用色素的生物毒性時[11-12]、李翔等評價黃曲霉毒素對費氏弧菌發光毒性時[13]，以毒物濃度為橫坐標繪制的DRC曲線是非線性的，而以毒物濃度對數(lgC)為橫坐標繪制的DRC曲線則是線性的。本研究擬合得到的DRC呈S形，與湯淼等的研究結果[8]一致。

以上結果表明，3種疏水性農藥的濃度與費氏弧菌發光的抑制存在定量關系，因此可以利用費氏弧菌發光法快速評價其生物毒性。

3 結論

建立疏水性農藥對費氏弧菌1H00021短期微板發光毒性測定方法。疏水性農藥溶解于甲醇中，每個微孔的毒性測定體系為200 μL，包括30 μL農藥溶液、170 μL費氏弧菌菌懸液，最佳檢測時間為20 min。擬合得到疏水性農藥對1H00021毒性的DRC，以EC50為表征的3種疏水性農藥對費氏弧菌1H00021的發光毒性順序為多菌靈﹥溴氰菊酯﹥毒死蜱。3種疏水性農藥對費氏弧菌1H00021的發光毒性存在良好的劑量-效應關系，可以利用費氏弧菌微板發光法快速評價疏水性農藥的生物毒性。

表1 3種農藥的線性擬合和Log3P1函數擬合結果

注：y=a+b×x，其中，x為濃度值(C)的對數，a、b分別是用Origin 8.5對效應y和濃度x進行擬合得到的參數。y=a-b×ln(x+c)，其中a、b、c分別是用Origin 8.5對效應y和濃度x進行擬合得到的參數。