響應面法優化鹿角靈芝產胞內多糖的液體發酵工藝

徐 慧， 趙雙枝， 劉孝永， 張彥昊， 陳蕾蕾

(山東省農業科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室/農業部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南 250100)

靈芝是我國傳統名貴大型真菌[1-2]，可用于輔助治療腫瘤、調節免疫力、抗氧化、防衰老等，靈芝多糖是其主要功能活性物質之一[3-8]。鹿角靈芝是一種表面具有漆樣光澤、菌柄長、有多個分支、形似鹿角、因生長外界條件變化而異型生長的靈芝菌株，在自然條件下極為罕見，多通過人工培養方式獲取。傳統靈芝多糖主要從靈芝孢子粉和子實體中提取，近年來的研究顯示，通過深層發酵提取的靈芝多糖，較傳統方式的得率和功效具有優勢[9-10]。劉艷芳等對同種靈芝子實體、菌絲體和孢子粉多糖成分進行了比較，發現靈芝菌絲體中多糖含量最高，孢子粉中多糖含量次之，子實體中多糖含量最低[11]。在對小鼠巨噬細胞RAW264.7釋放一氧化氮(NO)產量的影響研究中發現，從菌絲體和子實體中提取的多糖活性表現良好，而孢子粉多糖呈低活性狀態，表明從靈芝菌絲體中制得的靈芝多糖具有產量高、活性優的特點。于浩瀚等以8個靈芝菌株為研究對象，比較菌絲體多糖、子實體的多糖含量發現，血芝的菌絲體多糖含量為子實體的30倍，進而證實通過深層發酵獲得靈芝多糖是切實可行的[12]。隨著生活水平的提高，人們的保健意識逐漸增強，僅靠傳統方式制取靈芝多糖已經遠遠不能滿足現在人們的需求，加上靈芝液體深層發酵生產的靈芝菌絲體胞內多糖具有產量高、質量穩定、生產周期短、成本低廉等優勢，適合用于產業化生產，是目前制備靈芝多糖的熱點研究領域[13-14]。

響應面法是一種通過對響應值逼近來預測真實值的試驗設計方法。運用響應面法不僅可以得到最優試驗方案，還可獲得變量和響應值之間的變化趨勢，達到減少試驗次數的目的，具有指導工藝參數優化、提高生產效益的優勢[15-16]。本試驗以鹿角靈芝液體發酵產胞內多糖得率為指標，對鹿角靈芝的液態發酵工藝進行單因素和響應面法優化，以期為液態發酵法生產鹿角靈芝多糖的工藝制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料 鹿角靈芝(GanodermaamboinenseNCPSLZ1)菌種，由中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號：M2015796。馬鈴薯，市售；麥麩，市售；大豆粉，市售。

1.1.2 培養基的配制 菌種保存及活化培養基：20%馬鈴薯、3%麥麩、3%葡萄糖、0.2% KH2PO4、0.1% MgSO4、2%瓊脂，pH值=7.0。將馬鈴薯洗凈，去皮，切成小塊，加麥麩和蒸餾水煮沸30 min，過濾。向濾液中趁熱加入其他試劑，融化后用試管分裝，于121 ℃滅菌30 min，制成試管斜面備用。

種子培養基：菌種培養基配方中不添加瓊脂，融化后根據需要分裝于三角瓶內，于121 ℃滅菌30 min備用。

1.2 儀器與設備

ZWY-2102恒溫培養振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；5804R臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；BL-58A滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；超凈工作臺，上海力申科學儀器有限公司；BPH-9000電熱恒溫鼓風干燥箱，北京醫療設備廠；WB-200水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 從保存母種的試管斜面中切出大豆大小的菌絲塊，接于斜面培養基的中部，于(27±2) ℃培養7 d。

1.3.2 種子液的制備 取大豆大小的活化菌絲塊3～4塊，接種于種子液培養基中，500 mL三角瓶裝液量為 300 mL，于(27±2) ℃、150 r/min搖瓶培養7 d。

1.3.3 發酵液的制備 取適量種子液接種于發酵培養基中，于(27±2) ℃、150 r/min搖瓶培養，分別考察碳源、氮源、馬鈴薯添加量與初始pH值、接種量、裝液量對鹿角靈芝菌絲體胞內多糖含量的影響。

1.3.4 鹿角靈芝胞內多糖的提取 將鹿角靈芝發酵液于 6 000 r/min 離心15 min，收集菌絲體，將菌絲體用蒸餾水多次洗滌并離心后真空冷凍干燥備用。取1 g凍干鹿角靈芝菌絲體，加50 mL蒸餾水煮沸提取60 min，過濾，濾渣重復提取1次，過濾，合并2次濾液，加3倍體積的無水乙醇混勻，于 4 ℃ 靜置12 h，離心，在沉淀中加適量蒸餾水復溶，即得鹿角靈芝胞內多糖粗提液。

1.4 鹿角靈芝多糖的測定方法

1.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制 準確稱取10 mg葡萄糖(于104 ℃烘干至恒質量)，定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖母液。準確吸取濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于具塞試管中，分別補水至2.0 mL。然后各準確加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5 mL硫酸，搖勻，置于40 ℃水浴保溫15 min，取出并迅速用流水冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、葡萄糖含量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.2 多糖含量測定 準確吸取1 mL鹿角靈芝多糖粗提液，稀釋50倍，取1 mL稀釋液，補水至2 mL，準確加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，于40 ℃水浴保溫15 min，取出并迅速用流水冷卻至室溫，于490 nm處測定吸光度。以蒸餾水為空白對照，根據葡萄糖標準曲線計算鹿角靈芝胞內多糖含量。

1.4.3 鹿角靈芝胞內多糖含量的計算 將樣品真空冷凍干燥后制得鹿角靈芝胞內多糖，測定多糖含量，按照以下公式計算鹿角靈芝胞內多糖得率：

式中：C為多糖含量，mg；V為提取液體積，mL；m為凍干菌絲體質量g。

1.5 單因素試驗

以鹿角靈芝胞內多糖含量為指標，分別考察碳源含量、氮源含量、裝液量、接種量、初始pH值和馬鈴薯添加量對鹿角靈芝產胞內多糖得率的影響，最終確定各個單因素最適水平及對鹿角靈芝胞內多糖影響顯著的單因素。

1.5.1 碳、氮源篩選試驗 分別以2%葡萄糖、山梨醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米粉和可溶性淀粉作為碳源，添加2%麥麩、20%馬鈴薯、0.2% KH2PO4和0.1% MgSO4，配成7種不同碳源的發酵培養基進行碳源的篩選試驗。分別以2%麥麩、(NH4)2SO4、酵母膏和大豆粉作為氮源，添加2%葡萄糖、20%馬鈴薯、0.2% KH2PO4和0.1% MgSO4，配成4種不同氮源的發酵培養基進行氮源的篩選試驗。

1.5.2 單因素試驗 在優選碳、氮源的基礎上，分別考察碳源添加量、氮源添加量、裝液量(500 mL三角瓶裝液量分別為50、100、150、200、250 mL)、接種量(5%、10%、15%、20%)、初始pH值(3、5、7、9、11)、馬鈴薯添加量(5%、10%、15%、20%、25%)對鹿角靈芝胞內多糖得率的影響，培養溫度為(27±2) ℃，轉速為150 r/min，培養82 h。

1.6 Box-Behnken試驗設計與響應面分析

在單因子試驗結果的基礎上，經過顯著性分析，選取對鹿角靈芝胞內多糖影響顯著的裝液量、接種量和葡萄糖添加量作為自變量，進行3因素3水平的響應面分析試驗。采用Design Expert 8.0.5軟件進行Box-Behnken試驗設計并對試驗結果進行響應面分析，建立響應面回歸模型[15-16]。對擬合的回歸方程進行方差分析，確定最優工藝參數及最優響應因子水平，并進行模型驗證。響應面試驗因素水平設計見表1。

1.7 數據處理與分析

所有試驗均重復3次。單因素試驗數據分析及作圖采用Origin 8.5軟件，單因素方差分析及顯著性比較采用SPSS軟件，多重比較采用LSD檢驗法。響應面試驗設計、數據處理、作圖及方差分析均采用Design Expert 8.0.5b軟件。

表1 響應面分析法試驗設計因子水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 葡萄糖標準曲線 以葡萄糖含量為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準曲線(圖1)，并得到回歸方程：y=8.542x-0.007，r2=0.999。

2.1.2 碳源篩選結果 從圖2可以看出，以葡萄糖、玉米粉和可溶性淀粉為碳源時，鹿角靈芝菌絲體的胞內多糖得率較高，而以山梨醇、蔗糖、乳糖和麥芽糖作碳源時，不利于鹿角靈芝胞內多糖的累積，因此以葡萄糖作為最適碳源。

2.1.3 氮源篩選結果 從圖3可以看出，以麥麩和酵母膏作為氮源有利于鹿角靈芝液體發酵菌絲體胞內多糖的累積，其中，以麥麩作為氮源時，胞內多糖得率最高，而麥麩價格低廉易得，因此，本研究以麥麩作為最適氮源。

2.1.4 碳源添加量 從圖4可以看出，葡萄糖添加量對鹿角靈芝菌絲體胞內多糖得率的影響較大。隨著葡萄糖添加量的增加，胞內多糖得率呈先顯著上升后顯著下降的趨勢，當葡萄糖添加量為3%時，鹿角靈芝胞內多糖得率達到最高值，因此葡萄糖添加量以3%為宜；當葡萄糖添加量為2%～4%時，鹿角靈芝胞內多糖得率較高，且不同水平間存在顯著差異。

2.1.5 氮源添加量 從圖5可以看出，當麥麩添加量為 1%～5%時，隨著麥麩添加量的增大，鹿角靈芝胞內多糖得率呈先上升后下降的趨勢；當麥麩添加量為3%時，鹿角靈芝胞內多糖得率達到大值，故麥麩添加量以3%為宜；當麥麩添加量為2%～4%時，鹿角靈芝胞內多糖得率較高，但不同水平間差異不明顯。

2.1.6 裝液量 從圖6可以看出，當500 mL三角瓶裝液量為50～250 mL時，對鹿角靈芝胞內多糖得率的影響顯著。隨著裝液量的加大，鹿角靈芝胞內多糖得率呈現先顯著上升后顯著下降的趨勢；當500 mL三角瓶裝液量為150 mL時，鹿角靈芝胞內多糖得率最高，故500 mL三角瓶裝液量以150 mL為宜。當500 mL三角瓶裝液量為100 ～200 mL時，鹿角靈芝胞內多糖得率較高，且不同水平間差異顯著。

2.1.7 接種量 從圖7可以看出，隨著接種量的加大，鹿角靈芝胞內多糖得率首先呈顯著上升的趨勢，當接種量為10%時，鹿角靈芝胞內多糖得率達最高值，之后隨接種量的增大，鹿角靈芝胞內多糖得率的變化不明顯，因此可見，接種量以10%為宜。在接種量為5%～20%范圍內，5%～15%的接種量對鹿角靈芝胞內多糖得率的影響顯著。

2.1.8 初始pH值 從圖8可以看出，隨著初始pH值的增加，鹿角靈芝胞內多糖得率呈先上升后下降的趨勢，當pH值為7時，鹿角靈芝胞內多糖得率最高，因此初始pH值以7為宜。當pH值為5～9時，鹿角靈芝胞內多糖得率較高，但不同水平間差異不明顯。

2.1.9 馬鈴薯添加量 從圖9可以看出，在馬鈴薯添加量為5%～20%的范圍內，隨著馬鈴薯添加量的增加，鹿角靈芝胞內多糖得率呈上升趨勢，當馬鈴薯添加量為20%時，鹿角靈芝胞內多糖得率最高，因此，馬鈴薯添加量以20%為宜。當馬鈴薯添加量為15%～25%時，鹿角靈芝胞內多糖得率較高，且添加量為20%、25%與添加量為15%間差異顯著。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 回歸模型的建立 在單因素試驗結果的基礎上，固定麥麩添加量為3%，馬鈴薯添加量為20%，初始pH值為7.0，采用中心組合設計方法，對裝液量(A)、接種量(B)和葡萄糖添加量(C)進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設計，結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

采用Design-Expert 8.05對數據進行多元回歸擬合，得到裝液量(A)、接種量(B)和葡萄糖添加量(C)對鹿角靈芝胞內多糖得率(Y)的回歸方程：Y=12.95+0.17A+0.53B+0.97C-0.13AB-0.09AC+1.09BC-4.54A2-2.03B2-1.88C2。

2.2.2 回歸模型的方差分析 對響應面試驗結果進行方差分析，由表3可以看出，本試驗建立的多元回歸模型中P<0.000 1，表明回歸模型極顯著，說明不同處理間差異極顯著；模型失擬項P>0.05，說明模型失擬項不顯著，試驗誤差較小[17]。模型決定系數R2=0.996 9，校正后的決定系數RAdj=0.993 0，表明該模型能較好地擬合實際試驗中響應值的變化，該回歸模型能對胞內多糖得率進行分析和預測。變異系數(CV)表示模型的置信度[18]，CV與模型置信度成反比，本模型的CV為2.81%，表明該模型能較好地體現試驗值。其中，B、C、BC、A2、B2、C2對鹿角靈芝胞內多糖得率有極顯著影響(P<0.000 1)，A、AB、AC對鹿角靈芝胞內多糖得率影響不顯著。各影響因素對鹿角靈芝胞內多糖得率的影響依次是C(葡萄糖添加量)>B(接種量)>A(裝液量)。

表3 響應面試驗結果方差分析

注：“*”表示影響顯著(P<0.05)；“**”表示影響極顯著(P<0.01)。R2=0.996 9，RAdj=0.993 0，CV=2.81%。

2.2.3 響應面分析 圖10至圖12反映了接種量、裝液量和葡萄糖添加量與響應值鹿角靈芝胞內多糖得率的關系。響應面三維圖和等高線圖能反映2個變量間的相互作用，此時其他變量處于中心水平。響應面圖中響應面的變化弧度平緩，表明試驗因素對響應值影響程度較小，反之則表示影響較大；等高線形狀反映因素間交互影響的強弱，橢圓形表示因素間交互影響顯著，圓形則表示交互作用影響不顯著[19-22]。由圖10、 圖11可知， 裝液量對鹿角靈芝胞內多糖得率的影響大于接種量、葡萄糖添加量。由圖12可知，響應面弧度陡峭，等高線呈橢圓形，說明接種量和葡萄糖添加量都對鹿角靈芝胞內多糖得率有交互影響，且二者的交互影響顯著。

2.2.4 模型驗證 通過對鹿角靈芝液體發酵工藝的優化，得到鹿角靈芝胞內多糖得率的最佳工藝條件：裝液量為 150.58 mL，接種量為11.08%，葡萄糖添加量為3.32%，在此條件下鹿角靈芝胞內多糖得率為13.16%。 考慮到試驗實際操作性，將最佳發酵工藝調整為裝液量151 mL、接種量11%、葡萄糖添加量3.3%。在此工藝條件下做5次平行試驗進行驗證，得到鹿角靈芝胞內多糖的實際得率為12.94%，與預測值相對誤差小于5%，表明該方程與實際情況擬合良好，相應優化模型真實可行，具有指導生產的實用價值。

3 討論

靈芝多糖是靈芝中發現較早的有效成分，也是衡量靈芝保健功能的一個主要指標。之前的研究已證明，靈芝菌絲體中的靈芝多糖的含量普遍高于傳統人工栽培或野生靈芝中的靈芝多糖含量[23]，加上液態深層發酵技術的日趨成熟，使得深層發酵制備靈芝多糖變成獲取靈芝功能成分的主要方向[24-27]。

深層發酵是一種將微生物細胞置于底物中培養，最終達到表面培養形成鮮明對照狀態的技術。隨著抗生素發酵技術的發展，食用菌深層發酵工藝也逐漸成為研究熱點，目前，靈芝深層發酵的研究主要集中在培養基和發酵工藝優化方面。有研究發現：靈芝深層發酵多以葡萄糖、蔗糖、玉米粉為最適碳源，且碳源添加量不宜超過3%，這是由于靈芝為低糖發酵，糖濃度過高會造成菌絲體細胞脫水死亡[28]；氮源是靈芝深層發酵的重要成分，有機復合氮源比無機氮源更有利于功能成分的合成；由于鉀對糖酵解有促進作用，糖代謝過程受磷酸鹽的影響，鎂影響碳源的氧化，因此靈芝深層發酵中最重要的無機鹽為鉀、鎂、磷酸鹽[29]；深層發酵中的裝液量會影響溶氧量，而氧含量對多糖合成又有顯著促進作用，因此裝液量通常為30%左右[30]。從試驗結果可以看出，本研究優化得到的鹿角靈芝液體發酵產胞內多糖工藝條件，與前人研究靈芝液體發酵產胞內多糖條件相近。譚才鄧等以靈芝胞內多糖為指標，采用麥芽糖含量為2%、酵母提取粉含量為2%、ZnSO4含量為0.015%、維生素B1含量為0.1%、KH2PO4含量為0.2%、MgSO4含量為0.05%的培養基組合，最終胞內多糖產量為6.64%[31]。相比之下，本試驗培養基的優勢在于構成簡單，原料利用了農產品及加工副產物，價格低廉，且經響應面優化靈芝胞內多糖得率達12.94%，高于相關文獻報道的靈芝深層發酵胞內多糖得率，但本試驗參數為搖瓶水平，擴大生產培養至生產水平仍需進一步進行優化試驗作理論參考。

4 結論

本試驗以鹿角靈芝胞內多糖得率為指標，通過單因素試驗和響應面法優化液體發酵培養工藝，確定最佳發酵工藝條件為20%馬鈴薯、3.3%葡萄糖、3%麥麩、0.2% KH2PO4、0.1% MgSO4，初始pH值=7.0，接種量為11%，500 mL三角瓶裝液量為151 mL，轉速為150 r/min，發酵時間為82 h。在此發酵工藝下，鹿角靈芝胞內多糖得率為12.94%，與優化模型預測值13.16%相比，相對誤差小于5%，表明該優化模型真實可行，對生產有一定的實用價值。