淫羊藿藥渣總氨基酸水解液分析及其制備工藝優化

楊 勇， 楊小生， 楊 玲， 楊 娟

(1.貴州大學藥學院，貴州貴陽 550025； 2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550014)

隨著我國中藥資源的迅速推廣與利用，全國各大藥企的藥渣廢棄量日益增加，年排放量達3 000萬t[1]。當前，藥渣被廣泛應用于眾多行業中，如造紙、栽培食用菌、生產有機肥、處理廢水和用作飼料添加劑等[2]。藥渣中除了含有粗纖維、粗蛋白質和微量元素等營養成分外，還殘留一定量的多糖、黃酮[3]和萜類等生物活性成分。如何高值化利用這些功能性成分成為當前研究的熱點。

氨基酸作為機體必需的營養素，對其進行分析是利用該營養素的必要前提[4]。總氨基酸含量分析的方法有凱氏定氮法、茚三酮顯色法、考馬斯亮藍法、高效液相色譜(HPLC)柱前/柱后衍生化法[5]等。茚三酮顯色法在氨基酸定量分析中具有靈敏度高、成本低廉、過程簡易、分析迅速等優點[6]。但是，由于不同樣品含氮組分比例不同，茚三酮顯色法對于不同樣品的氨基酸含量測定都會產生一定誤差。因此，本試驗以高效液相色譜法和凱氏定氮法測定值作為參考指標，考察茚三酮顯色法對淫羊藿藥渣水解液中總氨基酸定量分析的適用性和準確性。

淫羊藿經水提后，藥渣中仍剩余大量的功能性成分，如粗蛋白、總黃酮、萜類等。因此，將淫羊藿藥渣作為禽畜類飼料添加劑加以利用，不僅能增強禽畜的抗病能力[7]，還能促進禽畜生長發育。但是，禽畜對淫羊藿藥渣的適應性較差，采食量較少。本試驗考慮將淫羊藿藥渣制成總氨基酸水解液，以快速簡捷的氨基酸定量分析方法為基礎，優化淫羊藿藥渣總氨基酸水解液制備工藝，為高效開發與利用淫羊藿藥渣功能性成分提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淫羊藿藥渣，由貴州同濟堂制藥有限公司提供；活性炭；精密pH試紙；內螺紋式消解管，購自鹽城慶勝實驗室裝備有限公司；濃硫酸、硼砂，均為優級純；其余試劑均為分析純。

UV-1800紫外-可見分光光度計；L-8900日立全自動氨基酸分析儀；SKD-100自動凱氏定氮儀；JKXZ06-20B恒溫消煮儀；FE-20K pH計；GZX-9023電熱鼓風干燥箱；AG285梅特勒-托利多電子分析天平。

1.2 茚三酮顯色法

1.2.1 樣品預處理 酸水解法：精確稱取100 mg干燥至恒質量的樣品，置于15 mL消解管中，加入10 mL 6 mol/L鹽酸溶液，然后置于(110±1) ℃烘箱中水解20～24 h，取出冷卻、過濾，調節至pH值為9.0[8]左右，脫色、過濾、離心，轉移上清液至50 mL容量瓶中，定容，作為供試品溶液。

1.2.2 對照品溶液的配制 精確稱取0.1 g干燥至恒質量的L-天門冬氨酸標準品，配制成1.00 mg/mL天門冬氨酸溶液，取該溶液稀釋10倍，即得100 μg/mL天門冬氨酸對照品溶液。

1.2.3 測定方法的考察

1.2.3.1 最大吸收波長的確定 取適量對照品溶液與供試品溶液，以水作為空白對照，于200～800 nm掃描最大吸收波長[9]，結果顯示，對照品無吸收峰，且供試品吸收峰不明顯。因此考慮加顯色劑，觀察結果。

1.2.3.2 磷酸鹽緩沖液用量的考察 精確移取1.0 mL對照品溶液至10 mL具塞刻度試管中，加水補足至2.0 mL[10]，以 1.0 mL 純水作為空白對照，分別加入pH值為6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，各加入1.0 mL 2.0%茚三酮溶液，于沸水浴中加熱15 min，冷卻，于567 nm處測定吸光度。

1.2.3.3 磷酸鹽緩沖液pH值的考察 與第“1.2.3.2”節同法操作，考察NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.5、8.0時對吸光度測定的影響。

1.2.3.4 顯色劑用量的考察 與第“1.2.3.2”節同法操作，考察顯色劑(2.0%茚三酮)用量分別為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL時對吸光度測定的影響。

1.2.3.5 沸水浴加熱時間的考察 與第“1.2.3.2”節同法操作，考察沸水浴加熱時間分別為10、15、20、25、30、35、40 min 時對吸光度測定的影響。

1.2.4 供試品方法學的考察

1.2.4.1 精密度試驗 精確移取1.0 mL供試品溶液，共9份，進行9次試驗(n=9)，按照第“1.2.3.2”節方法處理，測定吸光度。

1.2.4.2 穩定性試驗 精確移取1.0 mL供試品溶液，共9份，進行9次試驗，按照第“1.2.3.2”節方法顯色，分別于0、10、20、30、40、50、60 min后測定吸光度。

1.2.4.3 重復性試驗 精確稱取100 mg同一批次的淫羊藿藥渣，共9份，進行9次試驗，按照第“1.2.1”節的方法制備供試品溶液，每份精確移取1.0 mL該供試品溶液，按照第“1.2.3.2”節方法處理，測定吸光度。

1.2.4.4 回收率試驗 精確稱取100 mg淫羊藿藥渣粉末，共9份，進行9次試驗，按照第“1.2.1”節方法制備供試品溶液(經預試驗，測定100 mg樣品約含總氨基酸6.054 mg)，每份均精確加入5.0 mg天冬氨酸對照品，按照第“1.2.3.2”節方法處理，測定吸光度。

1.2.5 繪制標準曲線與供試品總氨基酸含量的測定 茚三酮-紫外可見分光光度法：取9支試管，分別加入0、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL 100 μg/mL天門冬氨酸標準溶液，加水補足體積至2.0 mL，加2.0 mL pH值為6.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液，最后每管加1.0 mL顯色劑，搖勻，于100 ℃水浴加熱15 min，測定吸光度，平行3次測定，繪制標準曲線。供試品同法操作，測定吸光度。總氨基酸含量計算公式如下：

Y=mV1/(1 000m1V2)×100%。

式中：Y為氨基酸含量，%；m為試樣中氨基酸質量，μg；V1為供試品溶液總體積，mL；V2為測試用供試品溶液體積，mL；m1為試樣質量，mg。

1.3 高效液相色譜法

試驗通過日立全自動氨基酸分析儀L-8900，采用茚三酮柱后衍生化法[11]進行氨基酸定量分析。試劑衍生化處理與具體分析過程參照GB/T 16631—2008《高效液相色譜法通則》。

1.4 全氮含量測定(凱氏定氮法)

通過SKD-100自動凱氏定氮儀測定全氮含量，測定參照朱杰等的方法[12-13]。

1.5 總氨基酸酸水解液制備工藝優化

1.5.1 單因素試驗 考察鹽酸濃度(2、4、6、8、10 mol/L)、水解時間(12、16、20、24、28 h)、水解溫度(100、105、110、115、120 ℃)3個因素的影響，將其中1個單因素作為變量，在其他2個條件相同的前提下，考察該因素對淫羊藿藥渣中氨基酸提取率的影響。

1.5.2 響應面分析 在單因素試驗的基礎上設計中心組合試驗，選取3個因素中合適的梯度范圍作響應面分析，優化總氨基酸水解液制備工藝。

1.5.3 優化酸水解后氨基酸提取率測定 以茚三酮顯色法測得的氨基酸含量作為氨基酸提取率的結果，測定參照第“1.2.3.2”節的方法。

2 結果與分析

2.1 茚三酮顯色法測定結果

2.1.1 方法考察結果與分析 方法考察結果顯示，加顯色劑后，掃描最大吸收波長時，200～800 nm光譜范圍內有2個明顯吸收峰，但200～440 nm處吸收峰有拖尾現象，且分離度較低，可能會造成較大的試驗誤差，而在500～700 nm處吸收峰呈單峰，峰形明顯，對稱性良好，因此取該波段的最大吸收波長567 nm作為本試驗的檢測波長。當磷酸鹽緩沖液用量為2.0 mL、pH值為6.0、顯色劑用量為1.0 mL時，吸光度最大，反應最完全；當沸水浴加熱時間為15 min時，吸光度達到最大值，超過15 min后，顯色劑有氧化趨勢，溶液逐漸由紫色轉變成棕黃色，在567 nm處不再出現明顯的吸收峰。因此，考慮沸水浴加熱時間為15 min。

2.1.2 供試品方法學考察結果 本研究顯示，在考察精密度時，9組供試品溶液的吸光度相對標準偏差(RSD)為0.69%，說明此方法符合樣品的精密度測試要求；在考察穩定性時，9組供試品溶液在40 min內測定，吸光度的RSD<2%(40 min時測定吸光度的RSD為1.98%)，而當50 min時測定，9組供試品溶液的吸光度RSD>2%。因此可見，本試驗顯色后測定吸光度盡量應控制在40 min內完成，才能符合該樣品的穩定性測試要求；進行重復性試驗考察時，9組供試品溶液總氨基酸平均含量為6.05%，RSD為1.5%，表明該方法重復性較好。加樣回收率試驗考察結果見表1，可見該方法的分析誤差在±2.0% 范圍內，在氨基酸微量分析中符合要求。

表1 供試品總氨基酸含量測定的加樣回收率試驗

注：RSD=0.69%。

2.1.3 供試品總氨基酸含量測定結果 通過紫外-可見分光光度法，繪制得標準曲線方程為y=0.018 5x-0.790 1，r2=0.995 1，使用方法考察的最佳檢測條件進行3組平行試驗，茚三酮顯色測得淫羊藿藥渣中總氨基酸含量平均為6.12%。

2.2 高效液相色譜法測定結果

淫羊藿藥渣水解液中含有絕大多數天然氨基酸，以天門冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸為主，天門冬氨酸含量最高，為1.03%(保留時間為31.074 min)，總氨基酸含量為4.29%。高效液相色譜結果見圖1。

2.3 凱氏定氮法測定結果

本研究測得淫羊藿藥渣中全氮平均含量為6.58%，高于高效液相色譜法和茚三酮顯色法的檢測結果。

2.4 3種測定方法的結果比較

用茚三酮顯色法、高效液相色譜法、凱氏定氮法測得淫羊藿藥渣中全氮含量分別為6.12%、4.29%、6.58%。由于淫羊藿藥渣中的氮主要以有機氮和無機氮的形式存在[14]，其中氨氮是指以氨、銨離子或以NHx形式存在的氮[15]，氨基氮是指各種氨基化合物(主要是氨基酸)[16]，總氮包括氨、銨及硝酸鹽等所有氮化物的總和。根據茚三酮顯色的原理[17]，茚三酮顯色法測得結果為氨氮的百分含量，高效液相色譜法測得結果為氨基氮(氨基酸)的百分含量，而凱氏定氮法測得結果為總氮的百分含量。因此，從理論上分析，茚三酮顯色法測定結果應介于高效液相色譜法與凱氏定氮法測定值之間，實際測定結果符合理論分析的參考范圍。

2.5 總氨基酸水解液制備工藝優化結果

2.5.1 單因素考察試驗結果 由圖2可以看出，隨著鹽酸濃度的增加，氨基酸提取率先呈提高趨勢，當鹽酸濃度達到 6 mol/L 時，氨基酸含量最高，當超過此濃度時，氨基酸含量不再明顯升高。因此，選擇鹽酸濃度為4、6、8 mol/L進行后續響應面設計試驗。

由圖3可以看出，隨著水解時間的延長，氨基酸提取率先呈提高趨勢，當水解時間達到24 h時，氨基酸已經水解完全，繼續延長水解時間，可能會使部分氨基酸發生氧化，使檢測結果偏低。因此，選擇水解時間為20、24、28 h進行后續響應面設計試驗。

由圖4可以看出，當水解溫度達到115 ℃時，氨基酸提取率最高，繼續升高溫度，則氨基酸提取率不再明顯升高。因此，選擇水解溫度為105、110、115 ℃進行后續響應面設計試驗。

2.5.2 響應面法結果與分析 通過Design-Expert 8.05b軟件對響應值與各因素進行回歸擬合后，得到回歸方程[18]：

氨基酸提取率=-265.718 25+3.278 62A+1.468 88B+4.266 05C-7.656 25×103AB-0.022 625AC-7.812 50×103BC-0.042 500A2-0.011 250B2-0.017 200C2，r2=0.954 1。

模型P<0.000 1，失擬項>0.05，說明該模型具有極顯著差異，該方程的擬合度良好[19]，可信度高，可用于分析和預測氨基酸水解工藝最佳條件。

響應面設計的試驗結果見表2。由表3的響應面方差分析結果可知，3個因素對氨基酸含量的影響程度不一，由大到小分別為水解溫度>水解時間>鹽酸濃度。鹽酸濃度與水解溫度之間交聯影響極顯著，鹽酸濃度越高，溶液的沸點越低，所需要的水解溫度也越低(水解過程中溶液持續沸騰的狀態有利于氨基酸的水解)，當水解溫度提高10 ℃時，鹽酸濃度可降低至5.6～5.7 mol/L；此外，水解時間與水解溫度之間交聯影響極顯著，當水解溫度提高時，可以適當縮短水解時間，水解溫度每提高10 ℃，水解時間可減少8～10 h，但強酸高溫的環境很容易損害水解管密封圈和管蓋。通過響應面法優化，最佳水解條件[20]為鹽酸濃度5.90 mol/L、水解時間 23.41 h、水解溫度114.8 ℃。結合實驗室儀器精度情況，將最佳水解條件調整為鹽酸濃度6.0 mol/L、水解時間23.4 h、水解溫度115 ℃。該條件在驗證試驗中用于測定氨基酸提取率，平行測定5次，氨基酸提取率平均為6.50%，與預測值接近，且高于未優化水解條件的測定結果。因此可見，該響應面模型能較好地預測氨基酸提取率。

3 結論與討論

本試驗以GB/T 16631—2008《高效液相色譜法通則》和凱氏定氮法的測定值作為參考值， 考察茚三酮顯色法對淫羊藿藥渣中氨基酸定量分析的適用性與準確性，其測定結果為6.12%，介于上述2種方法測定結果之間，表明茚三酮顯色法可作為淫羊藿藥渣總氨基酸分析的快速簡捷的化學分析方法，能準確定量分析淫羊藿藥渣的總氨基酸含量。但其測定結果仍有一定偏差，分析其原因，可能是由于高效液相色譜法測定總氨基酸含量是委托貴州師范大學分析測試中心完成的，不同分析者預處理過程不一樣，氨基酸水解率不同；此外，樣品中的胱氨酸與半胱氨酸在強酸高溫的條件下會發生氧化，本試驗中考慮到胱氨酸和半胱氨酸在該樣品中含量所占比例不大，且這2種氨基酸的定量分析本來就不準確[21]。因此，為進行氨基酸的快速定量分析，本試驗的預處理未填充氮氣。茚三酮與氨基酸產生氨反應生成有色復合物，同時茚三酮有較強氧化性，還能與樣品的銨鹽、聯氨等還原性無機氨發生顯色反應，使得檢測結果偏高；此外，兩者預處理脫色工藝不一樣，脫色效果也不同，造成檢測結果也會出現偏差。

表2 響應面設計試驗結果

表3 回歸方程方差分析結果

本試驗對淫羊藿藥渣總氨基酸水解液制備工藝進行優化，優化試驗水解條件如下：鹽酸濃度為6.0 mol/L，水解時間為23.4 h，水解溫度為115 ℃。經驗證，在該條件下，氨基酸提取率為6.50%。淫羊藿藥渣作為一種可回收利用資源，提高氨基酸提取率有利于提高動植物對小分子營養成分的利用率，例如作為良好的禽畜飼料添加劑，生物工程培養菌培養液配料或食用菌栽培的生長因子等。本試驗通過建立快速簡捷、適宜的分析方法，定量分析淫羊藿藥渣中總氨基酸成分；同時，優化其總氨基酸水解液制備工藝，用以提高淫羊藿藥渣的二次利用率，為實現藥渣資源的高值化利用提供參考依據。