2，2′，4，4′，5-五溴聯苯醚(BDE-99)對巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻的致毒脅迫效應

王洪斌， 成 群， 熊文超， 胡業慶， 謝冰倩， 李士虎

(1.淮海工學院海洋生命與水產學院，江蘇連云港 222005； 2.江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇連云港 222005)

2，2′，4，4′，5-五溴聯苯醚(BDE-99)是一種多溴聯苯醚(PBDEs)，也是一種溴代阻燃劑。PBDEs擁有極為優異的阻燃性能、熱穩定性等，因此被廣泛用作電子電路、建筑家具、塑料制品、紡織等行業中。但是，這些產品在使用、焚燒和降解等過程中，不與PBDEs共價結合，這時PBDEs就會揮發到自然環境中[1-2]，之后經過大自然的各類循環進入海洋，并最終在沉積物和生物體體內積累[3]。大量研究和實證表明，PBDEs的化學結構與多氯聯苯(PCBs)極為相似，具有難降解、高脂溶性等特點，是一種新型的持久性有機污染物。2004年，歐洲部分國家已禁止八溴聯苯醚等PBDEs的投放使用。2006年，歐盟頒布明令禁止歐盟各國在電子商品中使用多溴聯苯醚[4]。

我國為發展中國家，每年使用多溴聯苯醚用作阻燃劑等也十分多。隨著PBDEs用量的增加，在大氣、沉積物或污泥、魚類、人體血液和脂肪組織、母乳等中均能檢測到其存在，而在水、沉積物和生物體中含量最高的是以BDE-47、BDE-99、BDE-100為主的低溴聯苯醚。

藻類作為海洋和陸地上的初級生產者，其價值在近幾十年來被越來越多的研究人員和學者看重。關于藻類的研究更是不勝其數，其中微藻的生態價值已經滲透到工業、農業等各方面。BDE-99一旦進入水體，開始“入侵”的對象就是浮游藻類。在“侵入”后便在食物鏈中傳播，進入水體和人體，從而危害生物體健康。

本研究選用常見的巴夫藻(Pavlocaviridis)和塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)為供試材料，以它們的生長量等為檢測參數，分析塔瑪亞歷山大藻和巴夫藻對不同濃度梯度BDE-99的致毒脅迫的響應，從而研究BDE-99對海洋微藻的毒性效應，以期證明多環芳烴化合物會對水環境帶來嚴重的破壞性，揭示海洋微藻在水環境污染治理及修復中的潛在應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻藻種均由淮海工學院海洋生命與水產學院藻類實驗室保存；本試驗中所用海水均取于江蘇省連云港市連島海域漲潮時，海水鹽度為31.00‰～32.00‰，經醋酸纖維素薄膜過濾后，于121 ℃高壓滅菌 20 min 后備用；BDE-99購自上海源葉生物有限公司(純度為98%)；二甲基甲酰胺(DMF)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；微藻培養采用通用的f/2營養液(自配)；其他化學試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 微藻培養及微藻細胞破碎 在250 mL錐形瓶中加入150 mL f/2營養液和10 mL藻種，混合均勻，置于光照培養箱中進行封閉式培養，光照度為3 000 lx，培養溫度為(22±1) ℃，光—暗周期為12 h—12 h。培養過程中每天定時搖動3次，搖瓶過程中隨機調換位置，以免光照不均勻。

量取20 mL待測藻液，于5 000 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀物加入10 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值為 7.8)中，采用超聲波破碎藻細胞(破碎條件：功率為195 W，超聲波工作時間為3 s，間歇時間為7 s，超聲波破碎強度為65%，總工作時間為10 min)，鏡檢無完整細胞后，于 5 000 r/min 離心10 min，取上清液用于檢測ACP、AKP、CAT活性及MDA含量。

1.2.2 DMF對微藻生長量的影響 BDE-99溶液用DMF配制，BDE-99母液濃度為5 μg/mL，使用時根據需要稀釋；在研究BDE-99對海洋微藻的影響時，可能會受到DMF的干擾。在藻類生長至對數生長期時，分別在巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻試驗組中加入0、50、100、200、400、800 μL DMF溶液；用吸光度法(檢測波長為680 nm)檢測其生長量，24 h測定1次，直至120 h，試驗設置3個平行。

1.2.3 BDE-99對微藻生長量的影響 在微藻對數期添加不同濃度梯度的BDE-99，根據文獻[5]，分別在巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻試驗組中加入0、50、100、200、400、800 μL BDE-99的DMF溶液，對應濃度分別為0、1.67、3.34、6.68、13.36、26.72 μg/L；用吸光度法(檢測波長為680 nm)檢測其生長量，24 h測定1次，直至120 h，試驗設置3個平行。

1.2.4 ACP、AKP、CAT活性和MDA含量的測定 在微藻對數期分別添加0、6.68 μg/L濃度的BDE-99，對其ACP、AKP、CAT活性和MDA含量進行測定，時間間隔為24 h，直至120 h，試驗設置3個平行。ACP、AKP、CAT活性和MDA含量的測定按照試劑盒的說明書進行。

2 結果與分析

2.1 DMF對2種海洋微藻生長量的影響

由圖1可以看出，2種海洋微藻的生長量均呈現快速增長的趨勢，DMF各添加量試驗組與對照組的生長量幾乎相等，增長趨勢一致，可見DMF添加量增加對巴夫藻及塔瑪亞歷山大藻的生長沒有抑制作用，DMF作為BDE-99溶劑對本研究結果無明顯影響。

2.2 BDE-99對2種海洋微藻生長量的影響

如圖2所示，隨著處理時間增加，1.67 μg/L BDE-99試驗組的巴夫藻生長得最好，說明低濃度的BDE-99對巴夫藻有一定的刺激生長作用，120 h 時 26.72 μg/L BDE-99試驗組的巴夫藻生長受到最大抑制，抑制率為73%，與對照組相比，經t檢驗分析，差異極顯著(P<0.01)。除1.67 μg/L BDE-99試驗組外，BDE-99對巴夫藻的抑制作用具有明顯的劑量效應。隨著BDE-99濃度的增加，對塔瑪亞歷山大藻生長的抑制強度增大。與巴夫藻不同的是，除了1.67 μg/L BDE-99試驗組外，其他各個濃度試驗組對塔瑪亞歷山大藻生長的抑制作用均很強，3.34、6.68、13.36、26.72 μg/L BDE-99 試驗組對塔瑪亞歷山大藻生長抑制率分別為64%、78%、74%、74%，與對照組相比，經t檢驗分析，差異極顯著(P<0.01)。

2.3 BDE-99對2種海洋微藻CAT活性的影響

按照第1.2.4節的方法，添加6.68 μg/L濃度的BDE-99處理2種微藻，0～120 h后的CAT活性變化見圖3。可以看出，在同一時間條件下，BDE-99對2種微藻CAT活性的影響有差異，巴夫藻CAT活性在處理24 h后開始升高，96 h達到最高值，與對照組相比，增加了47%，經t檢驗分析，差異顯著(P<0.05)，120 h后幾乎恢復至對照組水平；對于塔瑪亞歷山大藻，在同一時間條件下，自用BDE-99處理后24 h起，CAT活性即有增加，增加趨勢同巴夫藻，96 h達最高值，與對照組相比，增加31%，經t檢驗分析，差異顯著(P<0.05)，120 h恢復至對照組水平，略低于對照組。

2.4 BDE-99對2種海洋微藻AKP活性的影響

按照第1.2.4節的方法，用BDE-99處理2種微藻，0～120 h后AKP的活性變化見圖4。 可以看出， 隨著BDE-99暴露時間的增加，巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻的AKP活性先逐漸升高，巴夫藻的AKP活性于BDE-99處理72 h后達最高值，與對照組相比，升高43%，經t檢驗分析，差異顯著(P<0.05)，以后逐漸降低，處理120 h后恢復至對照組水平；塔瑪亞歷山大藻的AKP活性變化趨勢同巴夫藻，AKP活性在處理后48 h達到最大值，與對照組相比，升高40%，經t檢驗分析，差異顯著(P<0.05)，處理48 h以后逐漸降低，處理后120 h恢復至對照組水平。

2.5 BDE-99對2種海洋微藻ACP活性的影響

用BDE-99處理2種微藻0～120 h的ACP活性變化見圖5。可以看出，隨著BDE-99暴露時間的增加，2種微藻的ACP活性變化趨勢不明顯，巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻的ACP活性均于BDE-99處理72 h達到最高值，與對照組相比，升高15%，經t檢驗分析，差異不顯著，以后逐漸降低，120 h后恢復至對照組水平。

2.6 BDE-99對2種海洋微藻MDA含量的影響

用BDE-99處理2種微藻0～120 h的MDA含量變化見圖6。可以看出，隨著培養時間的增加，2種微藻的MDA含量整體上逐漸升高，特別是塔瑪亞歷山大藻的升高趨勢非常明顯，巴夫藻則在120 h達最高值，與對照組相比，提高56%，經t檢驗分析，差異極顯著(P<0.01)；塔瑪亞歷山大藻同樣在BDE-99處理后120 h達最高值，與對照組相比，提高95%，經t檢驗分析，差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

胡恒等進行了BDE-99等5種PBDEs對亞心型扁藻和鹽生杜氏藻的毒性試驗，結果顯示：對照組的2種微藻生長較好，當加入不同濃度的BDE-99后，2種微藻的生長均受到不同程度的抑制，高濃度的BDE-99等抑制鹽生杜氏藻生長的作用特別明顯[6]。BDE-99等對鹽生杜氏藻的生長呈現特殊的“興奮作用”[7-8]。在本研究中，BDE-99對2種海洋微藻的致毒脅迫也呈現出類似結果，低濃度(1.67 μg/L)的BDE-99對2種微藻均有刺激生長作用，高濃度的BDE-99有強烈的抑制作用并具有明顯的劑量效應，26.72 μg/L BDE-99 的試驗組對巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻生長的抑制率分別為73%、74%。2種微藻對BDE-99處理表現出相似的時間-劑量效應：隨著BDE-99濃度的增大，抑制作用顯著增強。綠色巴夫藻表現為隨著處理濃度的增大，出現緩慢生長的趨勢，波動性較大，抑制作用較低。由此可見，BDE-99對各種海洋微藻的致毒脅迫效應存在種屬差異。

本研究設計添加固定濃度(6.68 μg/L)BDE-99處理2種微藻，隨著培養時間的遞增，2種微藻的ACP活性變化趨勢不明顯，巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻的ACP的活性均于處理后72 h達到最高值，與對照組相比，分別提高18%、15%。隨著BDE-99暴露時間的增加，巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻的AKP活性逐漸升高，巴夫藻于BDE-99處理后72 h達到最高值，與對照組相比提高了43%，塔瑪亞歷山大藻的AKP活性變化趨勢同巴夫藻，AKP活性在BDE-99處理后48 h達到最大值，與對照組相比，提高了40%。在同一時間條件下，BDE-99對2種微藻CAT活性的影響有差異，處理后96 h巴夫藻、塔瑪亞歷山大藻的CAT活性分別增加47%、31%；2種微藻體內的CAT活性增加與BDE99的暴露時間呈正相關趨勢，CAT活性在高位持續至處理后96 h，ACP、AKP、CAT活性的變化反而說明2種海洋微藻對BDE-99的致毒脅迫產生應激響應，在短時間內刺激ACP、AKP和CAT活性升高，特別是CAT活性的劇烈變化程度明顯，結果與生長量的變化一致。

張智華等指出，小新月菱形藻的CAT活性和MDA含量在蒽菲芘作用下會有不同程度的升高，細胞損傷加劇[9]。任加云等指出，進入生物體中的污染物在分解代謝過程中能夠形成多種中間產物，并產生大量活性氧物質，造成生物體的氧化損傷，一些抗氧化防御系統能夠轉化超氧陰離子自由基，從而使得機體免受損傷[10-11]。在本研究中，用BDE-99脅迫2種微藻，結果顯示，2種微藻MDA含量隨著BDE-99暴露時間的增加而升高，特別是塔瑪亞歷山大藻的升高趨勢非常明顯，巴夫藻在處理后120 h達到最高值，與對照組相比，提高了56%，經t檢驗分析，差異極顯著(P<0.01)；塔瑪亞歷山大藻同樣在處理后120 h達到最高值，與對照組相比，提高了95%，經t檢驗分析，差異極顯著(P<0.01)。本研究結果顯示，塔瑪亞歷山大藻對BDE-99的響應較巴夫藻強烈，與上述生長量變化結果一致。本研究設定時間為120 h，由于BDE-99對巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻致毒效應較強，120 h后由于藻體本身的活性減弱，死亡率加劇而導致MDA含量仍然維持在高位。王麗平等也指出，熒蒽脅迫對藻細胞的膜脂質過氧化作用有明顯增強的跡象，藻細胞的MDA含量對熒蒽毒性較為敏感，是個潛在的有價值的參考指標[5]。

本研究從浮游藻類的視角，通過研究綠色巴夫藻和塔瑪亞歷山大藻的生長、部分抗氧化酶活性及MDA含量對 BDE-99 的致毒脅迫的響應，旨在揭示多環芳烴化合物對水環境污染的重要性，并研究了海洋微藻在水環境污染治理及修復中的潛在應用價值。