家禽羽毛降解菌WYM39的分離鑒定及其產(chǎn)酶特性

文冰潔， 李曉霞， 柯 欣， 蘭新慧， 賈良輝， 顏 華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

隨著現(xiàn)代社會(huì)家禽消費(fèi)量的不斷增加，家禽加工廠的副產(chǎn)品——羽毛也在快速積累[1]。羽毛占成熟家禽活體質(zhì)量的5%～7%[2]。一般家禽羽毛會(huì)被傾倒，被填埋或焚燒，造成土壤、水和空氣的巨大污染，羽毛的積累不僅導(dǎo)致環(huán)境污染，也是羽毛資源的浪費(fèi)[3]。羽毛的主要成分是角蛋白[4]，角蛋白富含二硫鍵[5]和疏水側(cè)鏈，使羽毛堅(jiān)韌而耐化學(xué)腐蝕[6]。傳統(tǒng)的降解羽毛的方法，如堿水解法和蒸汽高溫高壓水解法，不僅會(huì)破壞產(chǎn)物中的氨基酸[7]，同時(shí)消耗大量能量、造成成本高等問(wèn)題[8]。由于環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，生物降解羽毛的方法越來(lái)越受到人們的關(guān)注[9]。角蛋白不能被常見(jiàn)的蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等降解，但很容易被微生物產(chǎn)生的角蛋白酶水解[10]。細(xì)菌、放線菌、真菌等都可以產(chǎn)生角蛋白酶[11]，以絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶為主，在較寬的溫度范圍和pH值范圍內(nèi)具有活性[12]。角蛋白酶作為特殊的酶，不僅可以用于飼料和肥料產(chǎn)業(yè)，還可擴(kuò)展到洗滌劑產(chǎn)業(yè)、皮革工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)[4]。此外，角蛋白酶能滅活朊病毒，在此方面有應(yīng)用潛力[13]。為了豐富角蛋白降解的菌株資源，提供生長(zhǎng)快速、產(chǎn)酶量高、具應(yīng)用潛力的菌株，同時(shí)拓展角蛋白酶的獲得來(lái)源，為發(fā)現(xiàn)更高效的角蛋白酶奠定基礎(chǔ)，筆者采用以雞羽毛為唯一碳氮源的分離培養(yǎng)基，對(duì)從1處雞圈采集的土樣，經(jīng)初篩和復(fù)篩，選擇降解效果最為突出的1株菌(編號(hào)為WYM39)，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA分析及產(chǎn)酶條件和酶學(xué)特性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 2016年8月采集湖南省桑植竹林養(yǎng)雞場(chǎng)羽毛堆積處地表5 cm的土壤，室內(nèi)風(fēng)干后儲(chǔ)存于4 ℃。試驗(yàn)于2016年9月至2017年12月在西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院放線菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 培養(yǎng)基 羽毛粉培養(yǎng)基：羽毛粉10.0 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，121 ℃滅菌25 min；牛奶培養(yǎng)基：脫脂奶粉5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，115 ℃滅菌20 min；液體羽毛培養(yǎng)基：整根的羽毛10.0 g，K2HPO41.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.4 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃滅菌25 min。

1.2 羽毛降解放線菌的分離

1.2.1 土壤樣品的處理 稱(chēng)取(1.0±0.001) g土樣置于 80 ℃ 干熱消毒箱中處理2 h后，將其加入處理液[酵母膏 0.6 g，十二烷基硫酸鈉(SDS)0.005 g，生理鹽水10 mL，121 ℃ 滅菌25 min]，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)30 min。

1.2.2 使用羽毛粉培養(yǎng)基進(jìn)行分離及牛奶培養(yǎng)基初篩 將“1.2.1”節(jié)中的處理液稀釋為10-2、10-3、10-4、10-54個(gè)梯度，取稀釋后的處理液100 μL分別涂布于羽毛粉培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)。將樣品于28 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察1次，挑取單菌落于牛奶培養(yǎng)基上，通過(guò)觀察有無(wú)水解圈進(jìn)行初篩。

1.2.3 使用液體羽毛培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩 將初篩的菌株進(jìn)行傳代、純化，純化后接種于具有整根羽毛的液體羽毛培養(yǎng)基，將具有顯著降解作用的菌株保藏于50%甘油中。綜合其生長(zhǎng)情況，挑選1株生長(zhǎng)快、降解效果好的菌株(編號(hào)為WYM39)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 羽毛降解菌WYM39的鑒定

1.3.1 菌株形態(tài)特征掃描電鏡觀察 挑取菌株WYM39的孢子在羽毛粉培養(yǎng)基上劃線接種，在劃線處斜插入經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理的蓋玻片，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)天后用掃描電鏡觀察。

1.3.2 菌株16S rDNA測(cè)定 使用Kirby Mix法[14]提取菌株WYM39的總DNA，使用通用引物F27/R1522(引物F27序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物R1522序列5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡(jiǎn)稱(chēng)PCR)擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物連接pMD-18T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，選擇陽(yáng)性克隆，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將菌株WYM39的16S rDNA序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡(jiǎn)稱(chēng)NCBI)網(wǎng)站中進(jìn)行局部對(duì)比基本檢索工具(basic local alignment search tool，簡(jiǎn)稱(chēng)BLAST)分析，通過(guò)Mega 5.0，以Neibour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 菌株生理生化特征 菌株生長(zhǎng)溫度、最適pH值、NaCl耐受性、唯一碳源、唯一氮源、明膠液化、脲酶、淀粉水解、牛奶凝固與胨化、產(chǎn)H2S和纖維素分解試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[15]。

1.4 羽毛降解菌WYM39產(chǎn)酶條件研究

1.4.1 酶活的測(cè)定 本試驗(yàn)使用酪蛋白[casein(Sigma)]作為底物進(jìn)行菌株WYM39粗酶液的酶活測(cè)定，參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行酶活測(cè)定和酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。定義40 ℃下1 min每釋放1 μg酪氨酸，升高1個(gè)酶活單位。

1.4.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 將菌株WYM39接種于液體羽毛培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h，以菌液上清為粗酶液測(cè)定酶活。

1.4.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 菌株WYM39接種于液體羽毛培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)96 h，取粗酶液測(cè)定酶活。

1.4.4 初始pH值對(duì)菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 將菌株WYM39接種于初始pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的液體羽毛培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)96 h，取粗酶液測(cè)定酶活。

1.4.5 初始NaCl濃度對(duì)菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 將菌株WYM39接種于初始pH值為7.0，初始NaCl濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70 mg/mL的液體羽毛培養(yǎng)基中，于 30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)96 h，取粗酶液測(cè)定酶活。

1.5 對(duì)菌株WYM39酶學(xué)特性的初步研究

1.5.1 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響 粗酶液與底物反應(yīng)時(shí)，分別設(shè)置溫度為30、40、50、60、70 ℃，測(cè)定并記錄不同反應(yīng)溫度下的酶活。

1.5.2 反應(yīng)pH值對(duì)酶活的影響 使用幾種不同pH值的緩沖液配制pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的反應(yīng)底物，與粗酶液混合后于最適溫度下反應(yīng)，測(cè)定并記錄不同pH值對(duì)酶活的影響[16]。

1.5.3 WYM39粗酶液的溫度穩(wěn)定性 將粗酶液于30、40、50、60、70 ℃條件下處理30 min后，在最適溫度及最適pH值條件下測(cè)定酶活。

1.5.4 金屬離子對(duì)酶活的影響 在1 mL粗酶液中分別加入5、50、500、5 000 μmol的K+、Na+、Ca2+、Mg2+，混合后在 30 ℃ 放置30 min后測(cè)定酶活。

1.5.5 化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響 在1 mL粗酶液中分別加入1 mmol苯甲基磺酰氟(PMSF)、1 mmol乙二胺四乙酸(EDTA)、10 μLβ-巰基乙醇、10 μg十二烷基硫酸鈉(SDS)、10 μL 異丙醇、10 μg二硫蘇糖醇(DTT)、10 μL二甲基亞砜(DMSO)，混合后在30 ℃放置30 min后測(cè)定蛋白酶活。

1.5.6 測(cè)定底物特異性 分別以可溶底物偶氮酪蛋白、酪蛋白；不可溶底物天青角蛋白、羽毛粉測(cè)定菌株WYM39粗酶液的酶活，不同底物的酶活測(cè)量方法參照文獻(xiàn)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選及菌株WYM39角蛋白降解效果觀察

將采自雞圈地表的土樣處理后稀釋濃度為10-4倍涂布于羽毛粉培養(yǎng)基平板上，挑取能在其上生長(zhǎng)的單菌落接種在牛奶培養(yǎng)基平板上，將能夠在牛奶培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯降解圈的菌株傳代、純化，接種于整根羽毛配制的液體羽毛培養(yǎng)基中，選擇1株具有生長(zhǎng)快、降解效果好等特點(diǎn)的菌株進(jìn)行后續(xù)研究，將其編號(hào)為WYM39。菌株WYM39在接種量為1%、30 ℃、150 r/min培養(yǎng)4 d時(shí)，能將100 mL液體羽毛培養(yǎng)基中的1 g完整羽毛完全降解(圖1)。

2.2 菌株WYM39的形態(tài)特征

菌株WYM39在羽毛粉培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h，掃描電鏡觀察結(jié)果如圖2所示，基絲無(wú)隔不斷裂，直徑0.3～0.6 μm；孢子短桿狀，大小0.7～1.2 μm。在牛奶培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，能觀察到明顯降解圈，菌落呈圓形，有白色孢子氣絲，基絲黃褐色。

2.3 菌株WYM39的16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

提取菌株WYM39基因組DNA后，使用通用引物F27/R1522擴(kuò)增得到菌株WYM39的16S rDNA，進(jìn)行序列測(cè)定。菌株WYM39的16S rDNA序列大小為1 517 bp，將其在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST分析，通過(guò)Mega 5.0，以Neibour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。該菌株與中間型鏈霉菌(Streptomycesintermedius)的相似度最高，為99%。

2.4 菌株WYM39的生理生化特征

菌株WYM39不僅能利用葡萄糖等多種碳源，還能利用亮氨酸、甲硫氨酸等氮源，但不能利用天冬氨酸、谷氨酸。菌株WYM39可在含有150 mg/mL NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，且能分解明膠、淀粉，還能使牛奶胨化，但不能降解纖維素，也不能產(chǎn)生脲酶和H2S。其具體生理生化特征見(jiàn)表1。

2.5 菌株WYM39的產(chǎn)酶條件研究

2.5.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 如圖4所示，在培養(yǎng)時(shí)間為96 h時(shí)，酶活性出現(xiàn)峰值。發(fā)酵前期是菌體生長(zhǎng)的時(shí)間，后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(羽毛)被耗盡，酶活性降低，因此96 h是研究菌株WYM39產(chǎn)酶條件合適的培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)。

2.5.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 如圖5所示，在培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)酶活性最高，培養(yǎng)溫度低于25 ℃或高于35 ℃時(shí)，酶活性很低，說(shuō)明30 ℃是研究菌株WYM39產(chǎn)酶條件合適的培養(yǎng)溫度。

表1 菌株WYM39的生理生化特征

注：“-”表示陰性；“+”表示陽(yáng)性。

2.5.3 初始pH值對(duì)菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 如圖6所示，初始pH值在5.5～7.0時(shí)，酶活性在較高水平，在初始pH值為7.0時(shí)，酶活出現(xiàn)峰值，因此pH值為7.0是菌株WYM39產(chǎn)酶條件研究的合適初始pH值。

2.5.4 初始NaCl濃度對(duì)菌株WYM39產(chǎn)酶的影響 如圖7所示，初始NaCl濃度為0時(shí)酶活性最高，隨著初始NaCl濃度的升高，酶活逐漸降低，當(dāng)NaCl濃度高于30 mg/mL后酶活降至極低水平，結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果可知，菌株WYM39可在含有0～150 mg/mL NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但初始NaCl濃度為0是菌株WYM39產(chǎn)酶條件研究的合適初始NaCl濃度。

2.6 菌株WYM39粗酶液酶學(xué)特性研究

2.6.1 菌株WYM39粗酶液最佳反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性測(cè)定 如圖8所示，該酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃；溫度穩(wěn)定性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示，該酶在60 ℃下30 min后仍保存89%的酶活性。

2.6.2 菌株WYM39粗酶液最佳反應(yīng)pH值 如圖10所示，粗酶液在反應(yīng)pH值為8.0時(shí)酶活性最高，在pH值為7.5～9.0范圍內(nèi)能保持93%的酶活性。

2.6.3 化學(xué)試劑和金屬離子對(duì)菌株WYM39粗酶液酶活的影響 如表2所示，和粗酶液的酶活性相比，PMSF、EDTA對(duì)粗酶液的酶活性具有抑制作用，而DTT、β-巰基乙醇、異丙醇、SDS、DMSO能夠提高該酶的催化活性。

金屬離子對(duì)菌株WYM39粗酶液影響試驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，K+、Na+、Ca2+、Mg2+在低濃度(5 μmol/mL)時(shí)對(duì)粗酶液的酶活性幾乎沒(méi)有影響，但在高濃度(5000μmol/mL)時(shí)對(duì)酶活有抑制作用，其中Ca2+的抑制作用最強(qiáng)。

表2 化學(xué)試劑對(duì)粗酶液酶活力的影響

2.6.4 菌株WYM39粗酶液的底物特異性 如表3所示，粗酶液可以降解可溶的偶氮酪蛋白、酪蛋白，也可降解不可溶的羽毛和天青角蛋白。

表3 不同底物對(duì)粗酶液酶活的影響

3 討論與結(jié)論

在接種量為1%、30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)時(shí)，菌株WYM39能在4 d將100 mL以整根羽毛為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中的1 g羽毛完全降解，對(duì)雞羽毛有較強(qiáng)的降解能力。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化特征、16S rDNA基因序列分析、基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，初步確定菌株WYM39為鏈霉菌屬(Streptomyces)的1個(gè)菌株。當(dāng)反應(yīng)體系中的Ca2+達(dá)到50 μmol/mL或PMSF為1 mmol/mL時(shí)，粗酶液的活性被抑制，表明該酶屬于絲氨酸蛋白酶。菌株WYM39的粗酶液在反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)酶活最高，并在經(jīng)60 ℃處理30 min后仍能保存89%的酶活，有在高溫下應(yīng)用的潛力。在底物特異性試驗(yàn)的補(bǔ)充試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系添加10 μL/mL的β-巰基乙醇后，降解羽毛粉和天青角蛋白時(shí)酶活分別從4.97和 2.57 U/mL 提升到12.6和7.2 U/mL，分別提高了1.5和1.8倍，說(shuō)明還原劑的存在對(duì)角蛋白降解有重要作用。此外，本試驗(yàn)僅采用以羽毛為唯一碳氮源的液體培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方單一，有通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基配方提高產(chǎn)酶能力的潛力。