黑藻葉片PSⅡ葉綠素?zé)晒鈪?shù)對(duì)Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫的光響應(yīng)

高桂青， 呂順華， 盧 龍， 李 威， 計(jì) 勇， 游濟(jì)康

(1.南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西南昌 330031； 2.南昌工程學(xué)院土木與建筑工程學(xué)院，江西南昌 330099)

重金屬作為不可降解的污染物，對(duì)生物的危害日益受到全社會(huì)的關(guān)注[1]。鎘(Cd)是植物非必需和毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，鎘脅迫可誘發(fā)PSⅡ捕光復(fù)合體改變，從而抑制PSⅡ的捕光色素吸收光能、能量傳遞和能態(tài)激發(fā)效率[2]；另外，Cd脅迫可通過(guò)降低植物葉片葉綠素含量[3]、降低PSⅡ的活性、抑制環(huán)式和非環(huán)式光合磷酸化[4]等途徑，抑制植物對(duì)光能的吸收與電子傳遞、CO2固定等光合作用各過(guò)程。鋅(Zn)參與植物體光合作用、蛋白質(zhì)與核酸代謝，過(guò)量的鋅又會(huì)對(duì)植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成毒害[5]。由于重金屬元素之間的加和、協(xié)同、拮抗等作用使水體重金屬污染的評(píng)價(jià)和監(jiān)測(cè)更加復(fù)雜，如何正確評(píng)價(jià)重金屬元素之間的聯(lián)合作用對(duì)水環(huán)境治理具有重要的意義[6]。

黑藻是我國(guó)湖泊中廣泛存在的沉水植物，對(duì)重金屬具有較強(qiáng)的吸收積累能力[7]。目前，國(guó)內(nèi)外重金屬脅迫黑藻的研究主要集中在重金屬生理生化的傷害反應(yīng)[8-9]、細(xì)胞內(nèi)部亞顯微結(jié)構(gòu)變化[10]等方面，而采用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)研究鎘和鋅復(fù)合污染對(duì)黑藻脅迫機(jī)制的影響甚少。葉綠素?zé)晒鈪?shù)在探測(cè)逆境對(duì)光合作用的影響等方面具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、可靠等特性，能夠反映光合系統(tǒng)“內(nèi)在性”特點(diǎn)[11]，被看作研究植物光合作用與環(huán)境脅迫程度關(guān)系的有效探針[12]。

本試驗(yàn)以黑藻為研究對(duì)象，分析了Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫下黑藻葉片PSⅡ的最小熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)、有效量子產(chǎn)量(YⅡ)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量(YNPQ)、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量(YNO)、光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)等參數(shù)的變化，結(jié)合前人研究探討黑藻受脅迫后的光合生理狀態(tài)，旨在為闡明黑藻光合系統(tǒng)受Cd、Zn脅迫時(shí)光系統(tǒng)響應(yīng)機(jī)制提供參考，為修復(fù)湖泊生態(tài)系統(tǒng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

黑藻取自贛撫平原灌區(qū)六干渠，于2017年6月初選取長(zhǎng)勢(shì)一致(長(zhǎng)度為18 cm左右)的植物作為試驗(yàn)材料，將試驗(yàn)植株先種在裝有10%Hoaglands營(yíng)養(yǎng)的塑料箱中馴化7 d，再選取長(zhǎng)勢(shì)一致的黑藻20株移栽到圓形白色塑料桶(高度 47.5 cm、直徑22.5 cm)中，桶中底泥厚5 cm，種植后注入自來(lái)水，水深40 cm。整個(gè)試驗(yàn)在南昌工程學(xué)院生態(tài)園內(nèi)完成，塑料桶置于南昌工程學(xué)院生態(tài)園內(nèi)，環(huán)境溫度范圍為25～29 ℃。試驗(yàn)分為13組，種植20 d后，除對(duì)照組外，其余12組均加入不同濃度的CdCl2溶液和ZnSO4溶液進(jìn)行處理(濃度設(shè)計(jì)見(jiàn)表1)。重金屬的取值范圍結(jié)合了預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以對(duì)植株有一定脅迫效應(yīng)為宜。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫黑藻5 d后，采用德國(guó)WALZ公司的水下飽和脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(DIVING-PAM)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，測(cè)定于太陽(yáng)光尚未照射到水面之前進(jìn)行。測(cè)量前，葉片經(jīng)暗適應(yīng)20 min后將葉夾原位夾于黑藻體成熟葉片距離葉尖約2 cm處，開(kāi)啟檢測(cè)光[0.15μmol/(m2·s)]，得到暗適應(yīng)條件下的最小熒光Fo，再由飽和脈沖光[4 000 μmol/(m2·s)]測(cè)定最大熒光Fm。

表1 Cd、Zn單一及其復(fù)合脅迫的濃度設(shè)計(jì)

1.2.2 快速光響應(yīng)曲線 測(cè)定于09：30—11：30進(jìn)行，光合有效輻射(PAR)梯度分別為0、93、249、372、490、555、799、999、1 222 μmol/(m2·s)，每個(gè)強(qiáng)度的光化光照射10 s，測(cè)定最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)、有效量子產(chǎn)量(YⅡ)、調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額(YNPQ)、非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)額(YNO)、光化學(xué)熒光淬滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)、相對(duì)電子傳遞速率(ETR)等參數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，使用Excel 2016進(jìn)行繪圖。用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用SNK進(jìn)行多重比較分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫對(duì)黑藻Fo、Fm、Fv/Fm與Fv/Fo的影響

由圖1可以看出，充分暗適應(yīng)下各處理的Fo、Fm、Fv/Fm均隨著各重金屬處理組濃度的增大而降低。這表明隨著Cd、Zn處理組濃度的增加，黑藻的PSⅡ反應(yīng)中心受到的損害程度增大。

單一Zn脅迫下，F(xiàn)o和Fm下降幅度最小。而單一Cd脅迫，低濃度(≤2 mg/L)Fo和Fm降低幅度小于相同處理組復(fù)合脅迫(Cd+Zn)下的值；而在Cd2+較高濃度(>2 mg/L)脅迫下，單一Cd脅迫下，F(xiàn)o、Fm與Cd+Zn復(fù)合脅迫下的值較接近。這說(shuō)明低濃度的Cd+Zn復(fù)合表現(xiàn)為協(xié)同作用。

與對(duì)照組相比，除單一Zn 3 mg/L脅迫下Fv/Fm略有上升外，其他處理均隨著處理組濃度的增大而降低。而低濃度(Cd2+≤2 mg/L、Zn2+≤5 mg/L)時(shí)，在相同處理組下，單一Zn脅迫影響最小，Cd次之，復(fù)合脅迫降低最大。而在較高濃度(Cd2+>2 mg/L、Zn2+>5 mg/L)下，單一Cd影響最大，單一Zn脅迫影響最小，復(fù)合脅迫次之。這表明重金屬對(duì)黑藻的損害程度表現(xiàn)為：Zn脅迫

Fv/Fo與Fv/Fm呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，F(xiàn)v/Fo反映了系統(tǒng) PSⅡ 潛在活性，除了3 mg/L Zn脅迫Fv/Fo略有升高，其余均隨著處理組濃度的增大，PSⅡ潛在光化學(xué)效率均呈現(xiàn)不同程度的降低。表明低濃度(3 mg/L)的Zn處理能提高黑藻PSⅡ潛在活性。

2.2 Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫對(duì)黑藻YⅡ、YNPQ、YNO的光響應(yīng)

由圖2可知，隨著處理組濃度的增大，無(wú)論何種脅迫光系統(tǒng)Ⅱ的有效量子產(chǎn)量YⅡ基本顯著減小，但低濃度(≤3 mg/L)Zn單一脅迫時(shí)YⅡ略有增加。相同處理組下，復(fù)合脅迫使得YⅡ降低幅度最大，達(dá)86.99%，單一Zn脅迫降幅最小，單一Cd脅迫降低幅度次之。這表明重金屬離子使PSⅡ反應(yīng)中心受損，抑制光合作用的原初反應(yīng)，阻礙光合電子的傳遞過(guò)程，金屬離子對(duì)有效量子產(chǎn)量YⅡ的損害程度表現(xiàn)為：Cd+Zn 復(fù)合脅迫>Cd脅迫>Zn脅迫。

圖2顯示，與CK相比，濃度小于 4 mg/L 的Cd單一脅迫下的YNPQ均顯著增加(P<0.05)，最高增加了27.94%，出現(xiàn)在Cd濃度為0.5 mg/L處；而當(dāng)Cd濃度在7 mg/L時(shí)，YNPQ卻降低了83.82%，可能是較高濃度致死或破壞了植物調(diào)節(jié)性耗散機(jī)制。單一Zn脅迫中，低濃度(≤5 mg/L)降低了YNPQ，而高濃度增加了YNPQ；復(fù)合脅迫下，低濃度(Cd2+≤2mg/L、Zn2+≤5 mg/L)增加了YNPQ，而較高濃度(Cd2+>2 mg/L、Zn2+>5 mg/L)則降低了YNPQ。

由圖2可知，YNO均隨處理組濃度增加而增加。其中，Zn單一脅迫增幅最小，單一Cd脅迫增幅最大，而復(fù)合脅迫居中。說(shuō)明Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫均對(duì)PSⅡ造成一定程度的傷害，導(dǎo)致葉片吸收的部分光量子以非調(diào)節(jié)性能量耗散，其耗散程度表現(xiàn)為：Cd脅迫>Cd+Zn復(fù)合脅迫>Zn脅迫。

2.3 Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫對(duì)黑藻qP、qN與電子傳遞速率(ETR)的光響應(yīng)

qP是PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額。由圖3可知，濃度小于 5 mg/L 的Zn脅迫下qP無(wú)明顯變化，較高濃度(Zn2+≥5 mg/L)明顯降低。隨著單一Cd和復(fù)合脅迫濃度升高，qP都一直降低，說(shuō)明PSⅡ中開(kāi)放的反應(yīng)中心比例和參與CO2固定的電子減少。

qN反映PSⅡ反應(yīng)中心對(duì)天然色素吸收光能后以熱能形式耗散掉的光能部分，其值表示光合機(jī)構(gòu)的損傷程度。由圖3可知，隨濃度增加，Cd單一脅迫的qN呈先增后降趨勢(shì)，Zn單一脅迫是先降后增趨勢(shì)，而復(fù)合脅迫則是一直處于降低趨勢(shì)，很有可能是復(fù)合脅迫造成某些機(jī)制不可逆轉(zhuǎn)的傷害。

由圖4可知，Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫下，電子傳遞速率ETR隨著光合輻射強(qiáng)度PAR的增加均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，最大值基本出現(xiàn)在PAR為249 μmol/(m2·s)處。同種處理下，隨著處理組濃度的增加，ETR最大值明顯降低；且相同PAR下，隨著處理濃度的增加，ETR逐漸降低，表明隨著處理濃度的增加，黑藻的PSⅡ光化學(xué)反應(yīng)受到了抑制。

3 結(jié)果與分析

無(wú)論單一脅迫還是復(fù)合脅迫，除濃度≤3 mg/L的ZnFo、Fm、Fv/Fm、Fv/Fo脅迫略有升高外(圖1)，其余總體趨勢(shì)都是降低的，黑藻葉片PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生了光抑制。Fo降低可能是由Cd、Zn脅迫使得PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉或者失活，即原初電子受體QA全部氧化時(shí)的熒光水平降低引起的；也可能是PSⅡ天線色素的熱耗散導(dǎo)致Fo的降低。因沉水植物的生活特性，大量重金屬加入水體后，重金屬的毒性直接作用于植物葉片和莖，植物葉片葉綠體類囊體膜上的蛋白復(fù)合體部分失活造成了電子傳遞和光合磷酸化受阻致使Fm降低。重金屬處理后PSⅡ反應(yīng)中心出現(xiàn)光抑制的現(xiàn)象，PSⅡ電子傳遞受阻，因此在受到脅迫后Fv/Fm和Fv/Fo明顯降低(圖1)。

單一Zn脅迫下，黑藻Fo、Fm、Fv/Fm、Fv/Fo的降幅均小于單一Cd及Cd+Zn復(fù)合脅迫。表明Zn對(duì)黑藻的毒害作用小于Cd+Zn復(fù)合，可能因?yàn)閆n是植物必需元素，低濃度的Zn能促進(jìn)葉片光和色素的形成，高濃度則是抑制；Cd能導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，擾亂植物水分狀況，降低葉綠素含量和葉綠體數(shù)量，減少營(yíng)養(yǎng)元素吸收，削弱光合作用，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生金屬螯合肽和結(jié)合蛋白等解毒物質(zhì)，所以才出現(xiàn)Zn毒性

低濃度的Cd、Zn復(fù)合對(duì)Fv/Fm、Fv/Fo和YNPQ表現(xiàn)為協(xié)同作用，原因可能是：(1)低濃度的Zn隔斷Cd對(duì)硫蛋白生物合成過(guò)程的誘導(dǎo)表達(dá)信息的傳導(dǎo)途徑[8]，增強(qiáng)了Cd的毒害作用；(2)Zn刺激根部產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[13]，促進(jìn)了與Zn相似性質(zhì)Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，降低了植物對(duì)Cd的控制力。較高濃度表現(xiàn)為拮抗作用，原因可能是：(1)Zn和Cd具有相同的價(jià)態(tài)(2+)，近似相同的離子半徑，相似的化學(xué)性質(zhì)，可以相互取代，發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)；(2)Cd進(jìn)入細(xì)胞之后，競(jìng)爭(zhēng)Zn酶中Zn的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而取代鋅，使鋅酶活性降低，甚至完全喪失[8]。

PSⅡ反應(yīng)中心吸收的光量子主要通過(guò)3個(gè)途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)化與耗散，即YⅡ、YNPQ和YNO，所有占量子產(chǎn)量比例總和始終接近于1，即YⅡ+YNPQ+YNO=1。已有研究表明，Cd、Zn使植物超微結(jié)構(gòu)葉綠體膨脹、葉綠體膜斷裂；線粒體脊突膨脹和部分溶解、部分類囊體溶解和散到細(xì)胞質(zhì)中，造成光能的吸收、能量的轉(zhuǎn)換及光合電子傳遞受阻，從而降低光化學(xué)能量途徑轉(zhuǎn)化能的比例[14]。在一定濃度范圍內(nèi)，黑藻有能力通過(guò)自身的調(diào)節(jié)機(jī)制耗散掉過(guò)剩的光能而使PSⅡ反應(yīng)中心受傷害程度降低，實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)，但超過(guò)一定濃度范圍后，黑藻的自我調(diào)節(jié)機(jī)制無(wú)法承受，致使PSⅡ反應(yīng)中心受到不可逆轉(zhuǎn)的傷害。

qP反映了PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的比例，由圖3可知，較高濃度(Zn2+>5 mg/L、Cd2+>2 mg/L)Cd、Zn單一及復(fù)合脅迫可以明顯抑制黑藻葉片PSⅡ反應(yīng)中心的開(kāi)放比例和參與光化學(xué)反應(yīng)電子傳遞的能量，致使植物光合活性降低。

qN對(duì)葉綠體能量狀態(tài)的改變是非常敏感的，本研究中Zn單一脅迫下qN先降低后升高，說(shuō)明一定濃度范圍(5～10 mg/L)的Zn會(huì)刺激黑藻使其光保護(hù)能力增強(qiáng)；Cd單一脅迫下qN先升高而降低，說(shuō)明低濃度(≤2 mg/L)Cd會(huì)刺激黑藻的光保護(hù)能力增強(qiáng)，但超過(guò)一定范圍(≥7 mg/L)，它的光保護(hù)機(jī)制會(huì)受到不可逆轉(zhuǎn)的損害；Cd+Zn復(fù)合脅迫下，qN均是一直降低，說(shuō)明復(fù)合脅迫對(duì)黑藻光系統(tǒng)保護(hù)機(jī)損害強(qiáng)于Cd、Zn單一脅迫(圖3)。

本研究中3種脅迫下，在PAR為249 μmol/(m2·s)時(shí)，黑藻葉片ETR達(dá)到最大飽和，同時(shí)隨PAR增強(qiáng)呈現(xiàn)平緩下降的趨勢(shì)，黑藻對(duì)光的響應(yīng)能力隨光強(qiáng)增加而減弱(圖4)。這意味著PSⅡ反應(yīng)中心部分關(guān)閉或失活，過(guò)剩的能量以非光化學(xué)淬滅的形式耗散掉，一種形式是用于自身光合作用，另一種是增加熱耗散來(lái)避免強(qiáng)光對(duì)光合系統(tǒng)的傷害[15]。

4 結(jié)論

Cd、Zn單一和復(fù)合脅迫均使黑藻受到不同程度的毒害，其中單一Cd及Cd+Zn復(fù)合毒害程度嚴(yán)重。Cd污染嚴(yán)重水域通過(guò)測(cè)定熒光參數(shù)來(lái)指示污染程度。

低濃度(≤3 mg/L)Zn2+下，黑藻葉片F(xiàn)m、Fv/Fm、YⅡ等略有增加，可以適當(dāng)施加一定Zn促進(jìn)植物光合。

受到不同濃度重金屬毒害時(shí)，黑藻通過(guò)調(diào)節(jié)PSⅡ反應(yīng)中心開(kāi)放程度與活性，實(shí)現(xiàn)光保護(hù)能力，對(duì)Zn脅迫表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐性，Cd次之，Cd+Zn復(fù)合最小。高濃度重金屬脅迫導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心關(guān)閉或不可逆失活，表現(xiàn)出光抑制。