皂樹皂苷QS21增強豬支原體肺炎活疫苗滴鼻免疫小鼠效果評價

張珍珍，韋艷娜，王 佳，于巖飛，馮志新，邵國青，熊祺琰

(江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京210014)

豬支原體肺炎，又稱作豬氣喘病是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)感染引起的一種慢性呼吸道傳染病，具有高傳染性和高致病性，同時由于感染后造成生產性能降低，給養豬業帶來巨大的損失[1]。目前，國內外主要通過疫苗免疫來防控豬支原體肺炎[2-3]。豬支原體肺炎(168株)活疫苗臨床上通過肺內免疫具有很好的免疫保護效果。為了進一步拓展豬支原體肺炎(168株)活疫苗的臨床應用，目前主要圍繞豬支原體肺炎(168株)活疫苗新的免疫途徑進行開發。前期利用豬支原體肺炎(168株)活疫苗滴鼻免疫試驗豬，具有一定的免疫保護效果，但其免疫效果仍低于肺內免疫組[4]。因此需要配合佐劑提高豬支原體肺炎(168株)活疫苗滴鼻免疫效果。

現代中藥化學研究表明中藥包含的皂苷[5]、多糖[6]等成分具有良好的免疫調節作用，可以被開發成免疫佐劑。QS21是南美皂樹(QuillajaSaponariaMolina)樹皮中分離純化到的活性皂苷成分，其主要化學成分為酰化三萜糖甙，分子量為1990 Da[7]。以QS21作為主要成分的疫苗佐劑如AS01、AS04已批準應用于人用疫苗，能顯著增強疫苗的保護效率[8]。為了有效提高豬支原體肺炎(168株)活疫苗滴鼻免疫效果，研究擬利用QS21佐劑聯合豬支原體肺炎(168株)活疫苗滴鼻免疫小鼠，探討其免疫效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 豬支原體肺炎(168株)活疫苗，批號20170518，由農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室制備提供；QS21(商品名：VSP)購自賽德奧生物科技(北京)有限公司；小鼠IL-4 ELISA 檢測試劑盒、小鼠IL-17 ELISA檢測試劑盒、小鼠IFN-γ ELISA 檢測試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司。小鼠IgG抗體購自武漢博士德生物公司。小鼠IgA、IgG1、IgG2a抗體購自BETHYL公司。

1.2 動物分組及免疫 BALB/c雌性小鼠，購自揚州大學醫學比較中心。隨機分成3組，分別為QS21+疫苗組、疫苗組和對照組。QS21+疫苗組滴鼻免疫QS21(6.25 μg/只)和豬支原體肺炎(168株)活疫苗(107CCU/只)；疫苗組滴鼻免疫豬支原體肺炎(168株)活疫苗(107CCU/只)；對照組僅滴鼻同體積的PBS溶液。首免14 d后加強免疫1次，免疫劑量與首免一致。

1.3 抗體檢測 在末次免疫后第14天(D14)、第21天(D21)、第28天(D28)和第42天(D42)分別對小鼠進行眼框采血，每組8只，1000 g離心15 min，分離血清，檢測小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。D28和D42分別取小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)，每組5只，300 g離心10 min，收集上清，檢測其中IgA、IgG、IgG1和IgG2a抗體水平。

1.4 細胞因子檢測 D28和D42天收集小鼠血清和BALF，離心后收集上清。根據 ELISA 試劑盒說明檢測血清和BALF 中IL-4、IL-17和IFN-γ的含量。

1.5 數據分析 數據采用Graphpad軟件進行統計學分析，結果以均數±標準差表示，組間比較采用雙側t檢驗(two-tailed unpairedttest)分析，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 QS21聯合疫苗免疫對小鼠血清中IgG抗體及亞型的影響 QS21與豬支原體肺炎(168株)活疫苗共同滴鼻免疫小鼠，不同時間點眼眶取血并分離血清，利用ELISA法檢測小鼠血清中豬支原體肺炎(168株)活疫苗特異性IgG抗體水平。結果顯示(圖1)，對照組不能誘導產生活疫苗特異性IgG抗體；末次免疫14 d后，疫苗組能產生較高的活疫苗特異性IgG抗體，與對照組相比有顯著性差異(P<0.01)；QS21+疫苗組能夠顯著提高血清中活疫苗特異性IgG抗體水平(P<0.05)。同時，檢測了QS21對抗體亞型IgG1和IgG2a的影響，結果顯示，末次免疫28 d后，QS21能進一步提高活疫苗誘導的IgG1和IgG2a抗體水平，提示QS21能激活全身性體液免疫。

*表示與對照組存在顯著差異 (P<0.05)，**表示與對照組存在極顯著差異 (P<0.01)，#表示與疫苗組存在顯著差異 (P<0.05)The data labeled * was significant compared with control group (P<0.05). The data labeled ** was very significant compared with control group (P<0.01). The data labeled # was significant compared with vaccine group (P<0.05).圖1 ELISA檢測小鼠免疫后血清抗體水平Fig 1 ELISA detection of antibodies in mice serum post immunization

2.2 QS21聯合疫苗免疫對小鼠BALF中IgG及亞型和sIgA抗體的影響 進一步檢測QS21與豬支原體肺炎(168株)活疫苗共同滴鼻免疫小鼠后BALF中IgG抗體及亞型的變化，結果顯示，與疫苗組相比，末次免疫28 d后，QS21+疫苗組能夠顯著提高血清中活疫苗特異性IgG和IgG1的抗體水平(圖2)。sIgA是黏膜免疫中重要的抗體類型，單獨疫苗組僅在D42檢測到sIgA抗體的升高；而與疫苗組相比，QS21+疫苗組能顯著增強sIgA抗體水平(P<0.05)，表明QS21與疫苗共同滴鼻能顯著性增強小鼠的黏膜免疫反應。以上結果表明QS21誘導局部體液免疫。

2.3 QS21聯合疫苗免疫對小鼠血清和BALF中細胞因子的影響 IFN-γ是Th1型細胞因子的典型代表，IL-4是Th2型細胞因子的典型代表，IL-17是Th17型細胞因子的典型代表。通過ELISA法檢測了小鼠血清和BALF中IFN-γ、IL-4、IL-17的水平。結果顯示，疫苗組的血清中IFN-γ、IL-4和IL-17含量顯著高于對照組(P<0.01，P<0.05)，而QS21+疫苗組能進一步提升血清中IL-17的含量(P<0.05)，但對IFN-γ和IL-4的含量無顯著影響(圖3)。

*表示與對照組存在顯著差異 (P<0.05)，**表示與對照組存在極顯著差異 (P<0.01)，#表示與疫苗組存在顯著差異 (P<0.05)。The data labeled * was significant compared with control group (P<0.05). The data labeled ** was very significant compared with control group (P<0.01). The data labeled # was significant compared with vaccine group (P<0.05).圖2 ELISA檢測小鼠免疫后BALF抗體水平Fig 2 ELISA detection of antibodies in mice BALF post immunization

*表示與對照組存在顯著差異 (P<0.05)，**表示與對照組存在極顯著差異 (P<0.01)，#表示與疫苗組存在顯著差異 (P<0.05)。The data labeled * was significant compared with control group (P<0.05). The data labeled ** was very significant compared with control group (P<0.01). The data labeled # was significant compared with vaccine group (P<0.05).圖3 ELISA檢測小鼠免疫后血清IFN-γ、IL-4和IL-17水平Fig 3 ELISA detection of IFN-γ、IL-4 and IL-17 levels in mice serum post immunization

在BALF中(圖4)，與對照組相比，疫苗組未能升高IFN-γ、IL-4和IL-17含量(P>0.05)，而加入QS21佐劑之后，BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量極顯著升高(P<0.01)。以上結果表明QS21可以誘導細胞免疫應答。

**表示與對照組存在極顯著差異 (P<0.01)，##表示與疫苗組存在極顯著差異 (P<0.01)。The data labeled ** was very significant compared with control group (P<0.01). The data labeled ## was very significant compared with control group (P<0.01).圖4 ELISA檢測小鼠免疫后BALF中 IFN-γ、IL-4和IL-17水平Fig 4 ELISA detection of IFN-γ、IL-4 and IL-17 levels in mice BALF post immunization

3 討論與結論

初始CD4+T淋巴細胞在機體抗菌和抗病毒免疫調節過程中發揮重要作用，其分化方向及各類型細胞比例能夠影響機體的抗菌和抗病毒效應。初始CD4+T淋巴細胞可以分化為T輔助細胞，包括Th1細胞、Th2細胞和Th17細胞等。IFN-γ是Th1細胞活化和分化的重要標志。IFN- γ在呼吸道和肺中的分泌能夠直接殺死病原體并激活呼吸道中巨噬細胞，從而產生免疫保護作用。IL-4是Th2細胞活化的特征細胞因子，能增強B細胞的抗原遞呈能力，發揮抗炎作用。研究表明QS21能夠誘導Th1型細胞因子如IL-2、IFN-γ等[9]，以及Th2型細胞因子IL-4[10]的表達。研究發現利用QS21配合豬肺炎支原體活疫苗滴鼻免疫能夠顯著提高BALF中IFN-γ和IL-4的水平，表明QS21能同時增強局部的Th1和Th2型細胞免疫應答。

IgG亞型抗體的分泌水平也與Th1和Th2型細胞活化密切相關，其中IgG1分泌增多提示初始Th細胞向Th2型細胞分化，而IgG2a抗體量增多則提示Th1型細胞活化。QS21在誘導IgG1和IgG2a平衡中有重要的調節作用[10-11]。本研究結果顯示，QS21與豬支原體肺炎(168株)活疫苗聯合滴鼻免疫小鼠后，能夠顯著升高血清和BALF中IgG1和IgG2a的含量，表明QS21能夠同時激活黏膜和全身性的Th1和Th2型免疫應答，這一結果提示，QS21聯合活疫苗免疫誘導的Th1/Th2型免疫應答能夠對抗豬支原體肺炎感染，發揮免疫保護效果。

IL-17是Th17細胞分泌的重要細胞因子，在調節黏膜免疫和全身免疫中發揮著重要作用。IL-17可以通過多種途徑激活黏膜免疫[12]，一方面上調黏膜上皮細胞中多聚Ig受體水平進而提高sIgA的水平，另一方面還可以誘導聚免疫球蛋白受體的表達，促進B細胞向IgA分泌細胞分化。研究中檢測結果顯示，QS21聯合活疫苗滴鼻免疫小鼠后，BALF中IL-17的含量顯著高于疫苗組，同時sIgA抗體水平也顯著提高，表明QS21可以激活Th17細胞介導的黏膜免疫。SATO等研究表明血清中IL-17與豬支原體肺炎的病變程度呈負相關，提示IL-17對豬支原體肺炎的免疫保護非常重要[13]。本研究檢測結果也顯示，QS21聯合活疫苗滴鼻免疫小鼠后的血清中IL-17的含量顯著高于疫苗組，表明QS21激活的Th17型全身免疫有利于對抗豬支原體肺炎。

綜上所述，QS21能夠激活Th1、Th2 和Th17細胞免疫應答，表明QS21能有效激活免疫系統，提示QS21可作為豬肺炎支原體活疫苗的候選黏膜佐劑。以上研究可以為拓展豬支原體肺炎活疫苗的臨床應用提供實驗基礎。