市售雞蛋殼表面攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因假單胞菌的分離鑒定

杜金澤，呂 琴，金曉曉，王 碩，黃海龍，馬紅霞

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118)

雞蛋是日常生活中常見(jiàn)的食物，2000年以來(lái)，城市居民人均雞蛋年消費(fèi)量保持在10 kg以上[1]。全世界每年發(fā)生的腹瀉病有1.5億人，46.4%是食源性致病菌引起的疾病[2]。假單胞菌是嚴(yán)重危害動(dòng)物的食源性細(xì)菌之一。該菌可引起動(dòng)物體發(fā)生局部或全身不同程度的感染，條件性致病各日齡的蛋雞，使出殼率下降，導(dǎo)致大量死弱病雞[3]。陳力力等對(duì)雞蛋殼表面分離的細(xì)菌數(shù)量及種群結(jié)構(gòu)研究表明，以假單胞菌的分離率最高[4]。為了保護(hù)消費(fèi)者，很多國(guó)家法律規(guī)定對(duì)雞蛋進(jìn)行各種消毒措施，如紫外線輻射[5]，氣態(tài)臭氧[6]，氯氣[7]或熱處理[8]，以避免主要由假單胞菌、大腸桿菌等引起的疾病感染，使消費(fèi)者獲得安全、衛(wèi)生的雞蛋。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)吉林省四家蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)不同雞舍內(nèi)雞蛋殼表面細(xì)菌的分離培養(yǎng)，最終篩選出耐多粘菌素類和β-內(nèi)酰胺類藥物的假單胞菌，經(jīng)測(cè)序分析該假單胞菌分離株中攜帶CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因，這在國(guó)內(nèi)外尚屬首次發(fā)現(xiàn)[8-10]。本研究結(jié)果為臨床防治蛋雞假單胞菌病提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要培養(yǎng)基及試劑 SS培養(yǎng)基、Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；ESBL顯色培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)科馬嘉生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA Marker DL15000、DNA Marker DL2000、EX Taq PCR MasterMix購(gòu)自天根生化試劑(北京)有限公司;革蘭氏染液購(gòu)自南京建成科技有限公司；藥敏片購(gòu)自杭州生物試劑有限公司。

1.2 雞蛋的選取 選取吉林省某四家蛋雞場(chǎng)內(nèi)13個(gè)不同雞舍內(nèi)的雞蛋，每個(gè)雞舍隨機(jī)選取10枚雞蛋。

1.3 病原菌的分離 無(wú)菌采集雞蛋殼表面一定面積，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)后，取細(xì)菌純培養(yǎng)物分別接種于多粘菌素B固體培養(yǎng)基、多粘菌素E固體培養(yǎng)基、10%兔血瓊脂平板、SS固體培養(yǎng)基、麥康凱固體培養(yǎng)基和ESBL固體顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌染色特性及形態(tài)。

1.4 16S rDNA基因擴(kuò)增 取菌液按基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA，以其為模板利用16S rDNA通用引物進(jìn)行基因擴(kuò)增。上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。25 μL PCR體系，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。按照試劑盒步驟對(duì)產(chǎn)物回收，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.5 抑菌試驗(yàn) 參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)，利用瓊脂紙片擴(kuò)散法，檢測(cè)所分離細(xì)菌對(duì)上述藥敏紙片的敏感程度。

1.6 耐藥基因檢測(cè) 采用CTX-M引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，該引物擴(kuò)增593 bp的特異片段。上游引物：5'-GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG-3'；下游引物：5'-CGTGCGAGTTCGATTTATTCAAC-3'。25 μL PCR體系，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min， 95 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。按照試劑盒步驟對(duì)產(chǎn)物回收，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鏡檢 在LB固體培養(yǎng)基(圖1 A)和含多粘菌素的固體培養(yǎng)基(圖1 B)上生長(zhǎng)為邊緣光滑、整齊、菌落黃色、略透明狀微隆起的菌落；在10%兔血瓊脂平板上生長(zhǎng)為金屬色光澤的菌落，周圍出現(xiàn)溶血環(huán)(圖1 C)；在ESBL顯色固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為半透明狀，綠色色素沉淀樣的菌落，表明該菌可能產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶(圖1 D)；鏡檢可見(jiàn)革蘭氏陰性桿菌(圖1 E)。

2.2 細(xì)菌基因組DNA提取結(jié)果 提取的產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)一條大于15000 bp的明亮條帶(圖2)。

2.3 分離菌株的16S rDNA基因序列分析 16S rDNA引物PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1500 bp左右有明亮的條帶，與目的條帶相符(圖3)。測(cè)序得到的核苷酸序列在NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)比分析，結(jié)果顯示該菌與已知假單胞菌同源性為95.7%～96.2%(圖4)，結(jié)合該菌株的培養(yǎng)染色特征，可確定分離菌株為嗜麥芽窄食假單胞菌。

A:LB固體培養(yǎng)基；B:多粘菌素固體培養(yǎng)基；C:10%兔血瓊脂平板；D:ESBL固體培養(yǎng)基；E:革蘭染色鏡檢(× 1000)圖1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢結(jié)果Fig 1 Results of bacteria culture and staining

M:DL15000 DNA Marker；1～4:細(xì)菌基因組DNA提取結(jié)果；5:陰性對(duì)照M:DL15000 DNA Marker；1～4: Results of bacterial genome DNA extraction；5:negative control圖2 細(xì)菌基因組DNA提取結(jié)果Fig 2 Results of bacterial genome DNA extraction

M:DL2000 DNA Marker；1～4: 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5:陰性對(duì)照M:DL2000 DNA Marker；1～4:PCR results of 16S rDNA gene；5:negative control圖3 分離菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 3 PCR results of 16S rDNA gene from isolated bacteria

圖4 分離菌株16S rDNA同源性比較Fig 4 Homology comparison of nucleotide sequences of 16S rDNA gene

2.4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果 4株嗜麥芽窄食假單胞菌同時(shí)對(duì)頭孢曲松、多粘菌素E、阿莫西林3種藥物100%耐藥，對(duì)環(huán)丙沙星100%高度敏感，對(duì)磷霉素100%中度敏感，對(duì)林可霉素、氟苯尼考75%中度敏感，對(duì)阿米卡星50%中度敏感(表1)。上述結(jié)果表明，該菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物(頭孢曲松、阿莫西林)和多粘菌素類藥物具有很強(qiáng)的耐藥性。

表1 分離菌株抑菌試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 The results of isolated strains bacteriostasis test

2.5 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 CTX-M引物PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在593 bp處有明亮的條帶，與目的條帶相符(圖5)。說(shuō)明所分離的4株嗜麥芽窄食假單胞菌均攜帶β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因。

M:DL2000 DNA Marker；1～4:假單胞菌菌株；5.陰性對(duì)照M:DL2000 DNA Marker；1～4:Pseudomonas strain；5:negative control圖5 β-內(nèi)酰胺酶基因PCR結(jié)果Fig 5 The PCR results of β-lactamase gene

3 結(jié) 論

隨著生活水平的不斷提高，食品安全問(wèn)題越來(lái)越成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要因素之一。然而，在雞蛋的生產(chǎn)、運(yùn)輸和保存過(guò)程中，很多與蛋殼接觸的因素都可能造成雞蛋的污染，雞蛋對(duì)微生物的侵入雖有一定的自衛(wèi)能力(如溶菌酶的殺菌作用)，但隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng)、貯存溫度變化，這種能力將會(huì)減弱，最后導(dǎo)致有害微生物侵入蛋內(nèi)并繁殖。近年來(lái)，臨床上由假單胞菌引起的人和畜禽感染越來(lái)越多[9]，而且隨著抗生素的過(guò)度使用，使其耐藥性不斷上升，給臨床用藥帶來(lái)很大困難。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明該假單胞菌分離株的多重耐藥性較為嚴(yán)重，對(duì)選取的8種藥敏紙片，最高可達(dá)到5耐的高度。因此，在臨床用藥之前必須進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，從而提高治療效果，減少使用無(wú)效藥物造成的經(jīng)濟(jì)損失。在已有文獻(xiàn)中，從人血液、雞腸道內(nèi)等分離出了攜帶CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的假單胞菌[10-12]，而本試驗(yàn)從雞蛋殼表面分離出攜帶此耐藥基因的假單胞菌在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。臨床研究證實(shí)，CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制[13]。本試驗(yàn)首次從吉林省四家蛋雞場(chǎng)內(nèi)雞蛋殼表面成功分離出4株攜帶CTX-M型β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的嗜麥芽窄食假單胞菌，為進(jìn)一步研究假單胞菌對(duì)蛋雞養(yǎng)殖的危害和食品衛(wèi)生安全提供了試驗(yàn)依據(jù)，后續(xù)試驗(yàn)將擴(kuò)大樣品數(shù)量及耐藥性的檢測(cè)，以便更加充分掌握雞蛋殼表面假單胞菌的相關(guān)數(shù)據(jù)。