甘露醇和蔗糖對菊花低溫離體保存的影響

王小樂 遲天華 劉穎鑫 王海濱 張 飛 陳發棣 房偉民

(南京農業大學園藝學院/農業部景觀設計重點實驗室，江蘇南京 210095)

菊花(Chrysanthemum morifolium)為原產于我國的宿根花卉，是世界四大鮮切花之一，也是我國十大傳統名花之一，具有極高的觀賞和經濟價值[1-2]。目前菊花種質資源主要依靠田間保存，需消耗大量人力物力，且易受到澇害、蟲害、病害等影響，導致品種混雜、種性退化，甚至品種丟失[3-5]。

緩慢生長離體保存技術是指在人為控制下，通過改變培養環境、在培養基中添加化學物質等手段，使植株的生長速度減緩，延長繼代擴繁的時間，從而達到中長期保存的目的[6]。該技術具有不易受外界環境影響、占據空間小、節省人力和物力、可快速繁殖等特點[7-9]，近幾年已被廣泛運用于黃獨[10]、薄荷[11]、千里光[12]等多種園藝作物的種質資源保存。國外已采用離體保存技術保存菊花種質資源[13]，但目前在國內相關研究并不常見，王艷芳等[14]研究發現在23±2℃下，利用添加不同蔗糖與甘露醇配比的培養基對切花菊神馬試管苗進行離體保存，成活率達到60.00%，但其未采用低溫庫保存以進一步提高存活率和延長保存周期。此外，菊花不同基因型的生長特性差異明顯，對保存條件也有不同要求[15]，需要開展進一步研究以形成較為完善的低溫離體保存方案。

本試驗選取4個田間生長類型差異較大的菊花品種，在7±2℃離體庫中研究不同濃度甘露醇、蔗糖對菊花離體保存的影響，以期探索針對不同生長類型菊花品種合適的低溫離體保存方案，為菊花種質資源低溫離體保存提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4個田間生長類型差異較大的菊花品種蒙娜麗莎黃、橙安娜、小洋菊和南農橙乒乓無菌苗均來自于南京農業大學中國菊花種質資源保存中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 4個菊花品種離體生長狀況比較 4個品種分別接種10株帶1個腋芽的莖段(每試管1株)，并均設3次生物學重復，2個月后分別測量各品種菊花的株高、莖粗、節間長等指標。以MS＋7 g·L-1瓊脂為基本培養基，pH值為5.8±0.2，培養溫度為23±2℃，光照強度為 40～50 μmol·m-2s-1，光照時間為 8:00-20:00和23:00-2:00。

1.2.2 試管苗低溫離體保存比較 以MS＋7.0 g·L-1瓊脂為基本培養基，分別添加 45、60、75、90 g·L-1蔗糖和 0(CK)、5、10、15、20 g·L-1的甘露醇，30 g·L-1蔗糖處理作為對照，培養溫度為7±2℃外，其他培養條件同1.2.1。每3個月觀察統計1次試管苗成活率、綠葉數。

1.2.3 試管苗組織學觀察 低溫保存12個月后取最優濃度甘露醇處理的蒙娜麗莎黃、橙安娜、小洋菊和南農橙乒乓的莖段、葉片，以常溫下MS＋7 g·L-1瓊脂＋30 g·L-1蔗糖培養(60 d繼代一次)的試管苗為對照，石蠟切片，番紅-固綠染色后置于DM6B熒光顯微鏡(德國Leica公司)下拍照觀察。

1.2.4 恢復生長 低溫保存結束后取保存效果最好的處理轉至正常條件下恢復培養。恢復培養45 d后測量統計菊花株高、葉片數量、莖粗、節間長度和根系數。

1.2.5 遺傳穩定性鑒定 取恢復生長后植株嫩葉，采用CTAB法[16]提取DNA，SSR分子標記檢測遺傳穩定性；PCR擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染法[17-18]染色。

1.3 數據分析

利用SPASS 20.0和Microsoft Excel 2010對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 常溫下4個菊花品種離體生長狀況比較

由表1可知，培養2個月后，株高從高到低依次為蒙娜麗莎黃＞小洋菊＞橙安娜＞南農橙乒乓，且各品種間差異顯著；葉片數也表現為蒙娜麗莎黃＞小洋菊＞橙安娜＞南農橙乒乓，其中蒙娜麗莎黃的葉片數顯著多于其他品種；莖粗則表現為南農橙乒乓＞橙安娜＞小洋菊＞蒙娜麗莎黃，南農橙乒乓的莖粗顯著大于蒙娜麗莎黃和小洋菊，但與橙安娜無顯著差異；節間長表現為蒙娜麗莎黃＞小洋菊＞橙安娜＞南農橙乒乓，其中蒙娜麗莎黃和小洋菊無顯著差異，但均顯著高于橙安娜和南農橙乒乓；各品種間根系數均無顯著差異。綜上，4個菊花品種離體條件下生長勢存在明顯差異，具有較好的代表性。

表1 離體培養2個月4個菊花品種的形態指標Table1 Morphological indexes of 4 chrysanthemum cultivars cultured for 2 month in vitro

2.2 不同濃度甘露醇對菊花低溫離體保存的影響

由表2可知，9個月之前，各品種菊花不同處理間的存活率差異較小，12個月時各品種菊花間差異明顯，隨著甘露醇濃度的增加，蒙娜麗莎黃和橙安娜的存活率呈逐漸增加趨勢，甘露醇濃度為20 g·L-1時存活率達到最高，分別為80.00%和93.33%；而小洋菊和南農橙乒乓的存活率則隨著甘露醇濃度的增加呈先增加后降低的趨勢，且均在15 g·L-1甘露醇處理下存活率最高，分別達到93.33%和86.67%。

由圖1可知，保存12個月后，不同品種菊花的綠葉數變化趨勢與存活率一致。隨著甘露醇濃度的增加，蒙娜麗莎黃和南農橙乒乓綠葉數量逐漸增多，且在20 g·L-1甘露醇處理時綠葉數最多，顯著高于其他處理；而南農橙乒乓和小洋菊綠葉數隨著甘露醇濃度增加，呈先增加后降低的趨勢，15 g·L-1甘露醇處理下南農橙乒乓和小洋菊綠葉數均達到最高，生長狀態最好。

表2 不同濃度甘露醇對菊花低溫離體保存存活率的影響Table2 Effect of different concentrations of mannitol on the survival rate of chrysanthemum in vitro conservation at low temperature

綜上，15 g·L-1甘露醇對南農橙乒乓和小洋菊保存效果最好，而蒙娜麗莎黃和橙安娜最適甘露醇濃度為20 g·L-1，保存至12個月時，存活率最高，綠葉數最多。

2.3 不同濃度蔗糖對菊花低溫離體保存的影響

由表3可知，90 g·L-1高濃度蔗糖處理后的蒙娜麗莎黃、橙安娜和南農橙乒乓存活率大幅下降，到保存12個月時均降為0，而小洋菊保存6個月時的存活率均高于其他3個品種，12個月時存活率仍為26.67%；保存至12個月時，蒙娜麗莎黃各處理均已全部死亡，而其他3個品種存活率隨蔗糖濃度的升高，存活率呈先增加后降低的趨勢；橙安娜、小洋菊和南農橙乒乓分別在45、60和45(和60)g·L-1蔗糖處理下存活率最高，分別為40.00%、73.33%和73.33%。綜上，不同品種菊花離體保存對高濃度蔗糖耐受性存在差異，且蔗糖處理的存活率低于甘露醇處理。

由圖2可知，保存至12個月時各品種菊花不同濃度蔗糖處理綠葉數均較少。蒙娜麗莎黃已全部死亡；其他3個品種隨蔗糖濃度的增加，均呈先增加后降低的趨勢，橙安娜、小洋菊和南農橙乒乓分別在45、60和60 g·L-1蔗糖處理下綠葉數最多。綜上，蔗糖處理下4個品種菊花離體保存至12個月后，存活率均較低，且綠葉數少，植株生長狀態差，保存效果較甘露醇處理差。

2.4 菊花組織學觀察

低溫下保存12個月后，將20 g·L-1甘露醇處理的蒙娜麗莎黃和橙安娜、15 g·L-1甘露醇處理的小洋菊和南農橙乒乓與正常2個月繼代一次的對照試管苗相比，組織結構均發生了變化。具體表現為4個品種菊花植株葉片厚度變薄，葉肉細胞變小，細胞間隙減小，細胞密度增加(圖3)；且皮層細胞變小、密度增加(圖4)。

圖1 不同濃度甘露醇對菊花低溫離體保存綠葉數的影響Fig.1 Effect of different concentrations of mannitol on number of green leaves of chrysanthemum in vitro conservation at low temperature

圖2 不同濃度蔗糖對菊花低溫離體保存綠葉數的影響Fig.2 Effect of different concentrations of sucrose on the number of green leaves of chrysanthemum in vitro conservation at low temperature

表3 不同濃度蔗糖處理對菊花低溫離體保存存活率的影響Table3 Effect of different concentrations of sucrose on the survival rate of chrysanthemum in vitro conservation at low temperature

2.5 試管苗恢復生長和遺傳穩定性鑒定

由表4可知，20 g·L-1甘露醇處理的蒙娜麗莎黃和橙安娜低溫離體保存結束轉移到正常條件下培養可恢復生長，恢復生長后與CK相比，其植株形態正常，株高、莖粗、節間長、葉片數量、根系數等無顯著差異。與CK相比，15 g·L-1甘露醇處理的小洋菊恢復生長后其葉片數和根系數無顯著差異，而株高和莖粗顯著降低，節間長度顯著增加；南農橙乒乓節間長度顯著增加，其他指標無顯著差異。再次繼代培養后這2個品種菊花植株形態恢復正常，與CK相比差異不顯著。

利用選取的5條隨機引物對4個品種菊花再生植株進行SSR分子標記分析，由圖5可知，5條隨機引物在不同品種間擴增帶數介于6～18之間，4個品種菊花引物擴增總條帶數分別為61、58、57、61，與對照相比，均未出現變異條帶。說明低溫離體保存后4個品種菊花再生植株DNA水平上沒有發生變化，低溫下離體保存結束后保持了良好的遺傳穩定性。

3 討論

研究表明，甘露醇作為滲透調節物質，可形成滲透脅迫造成細胞水分與養分吸收困難、新陳代謝減弱，抑制試管苗的生長從而達到離體保存效果[19-21]。牛愛國等[22]研究表明，10 g·L-1甘露醇可使櫻桃試管苗保存7.5個月的存活率達62%；蘭偉等[23]研究表明，20 g·L-1甘露醇使香青蘭試管苗保存9個月的存活率達40%。本試驗在MS培養基中添加15 g·L-1甘露醇可使小洋菊和南農橙乒乓試管苗離體保存至12個月，存活率分別達93.33%、88.67%，與蝴蝶蘭[24]、甜葉菊[25]的最適甘露醇濃度一致，大于永春蘆柑[26](5 g·L-1)，但低于文心蘭[27](40 g·L-1)，說明不同植物對甘露醇滲透脅迫適應性存在較大差異。此外，本研究還發現添加20 g·L-1甘露醇可使蒙娜麗莎黃和橙安娜試管苗保存至12個月的存活率分別達到80.00%和93.33%，但20 g·L-1甘露醇對小洋菊和南農橙乒乓保存效果不佳，試管苗不生長，葉片緊縮變褐，逐漸死亡。徐志微等[28]研究發現，葡萄品種Melissa在50 g·L-1甘露醇的培養基中保存4個月后存活率可達65%，而巨玫瑰已經全部死亡，表明同種植物不同品種對甘露醇滲透脅迫適應也存在差異。

圖3 低溫離體保存12個月后菊花葉片組織橫切觀察Fig.3 The cross section of chrysanthemum leaves conserved for 12 months in vitro conservation at low temperature

圖4 低溫離體保存12個月后菊花莖段組織橫切觀察Fig.4 The cross section of chrysanthemum stem conserved for 12 months in vitro conservation at low temperature

高濃度的蔗糖可通過提高培養基滲透壓，抑制試管苗生長，從而延長保存時間[29-31]。本試驗結果表明，保存至12個月時除蒙娜麗莎黃全部死亡外，橙安娜、小洋菊和南農橙乒乓分別在45、60和45(和60)g·L-1蔗糖處理下存活率最高，分別為 40.00%、73.33%和73.33%，均高于對照，但試管苗綠葉數少，生長狀況差，效果不及甘露醇處理；而75～90 g·L-1蔗糖使試管苗植株生長高度減小、節間長度縮短，腋芽不萌發并逐漸變褐死亡，表明已對植株生長產生毒害作用。研究表明，高濃度的蔗糖對紀伊潮野菊[32]、木薯[33]、麥冬[34]等多種植物生長也會產生毒害作用。此外，本試驗發現小洋菊和南農橙乒乓對高濃度蔗糖的耐性明顯高于蒙娜麗莎黃和橙安娜，表明不同品種對蔗糖耐性也不同。有研究發現海棗Bartamoda在60 g·L-1蔗糖培養基保存至12個月存活率達55%，而Sakkoty已全部死亡[35]。不同植物對蔗糖耐性也不同，如大花卷丹離體保存適宜蔗糖濃度為90～110 g·L-1[36]，東方百合西伯利亞為 60～90 g·L-1[37]。

表4 不同濃度甘露醇處理對菊花低溫離體保存后再生植株形態指標的影響Table4 Effect of different concentrations mannitol on the morphological indexes of the regenerated plantlets after in vitro conservation at low temperature

圖5 再生植株的SSR分子標記圖譜Fig.5 Genetic stability of the regenerated plantlets with SSR

本研究中低溫保存結束后菊花試管苗的組織結構發生了一定的變化，具體表現為細胞變小、細胞間隙減小、密度增大，與賀川野菊[38]和野生毛葡萄[39]離體保存后的結果類似，其原因可能是植物細胞對低溫和甘露醇形成的滲透脅迫做出的適應性反應。小洋菊恢復生長后，與對照相比出現株高降低、葉片變小等現象，其原因可能是植株從不良環境轉移至正常條件下生長，需要一定的適應過程，再次繼代培養后植株形態恢復正常，與對照無差異，SSR-PCR擴增圖譜也未發現變異條帶，說明低溫離體保存后再生植株DNA水平上沒有發生變化，菊花在低溫下離體保存結束后保持了良好的遺傳穩定性。

4 結論

本研究結果表明，7±2℃下 MS培養基添加 15 g·L-1甘露醇對南農橙乒乓和小洋菊試管苗的離體保存效果最佳，而蒙娜麗莎黃和橙安娜在添加20 g·L-1甘露醇處理下效果最佳；相比甘露醇，高濃度蔗糖(45～90 g·L-1)對試管苗的保存效果不佳。4個品種菊花經低溫加甘露醇處理保存12個月后，試管苗恢復正常培養生長良好，且保持了良好的遺傳穩定性。本研究結果為菊花種質資源的低溫離體保存提供了理論依據和技術支撐。