人參皂苷Rg3對糖尿病皮膚損傷的AGEs表達(dá)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

起榮林 柯瑾 李靜平

摘要：目的?探討人參皂苷Rg3（Ginsenoside Rg3）促進(jìn)糖尿病（DM）皮膚創(chuàng)面愈合的作用機(jī)理。方法?雄性SD大鼠制備DM模型，隨機(jī)分為模型對照組、陽性藥組、Ginsenoside Rg3低、高劑量組，另設(shè)正常對照組。灌胃給藥4周后，取上述DM大鼠和正常大鼠，制備難愈創(chuàng)面。傷后21d，取創(chuàng)緣皮膚組織，檢測皮膚組織糖含量、免疫熒光染色檢測AGEs表達(dá);收集血漿，測定相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)（H2O2、MDA、GSH）。結(jié)果?與模型組比較，Ginsenoside Rg3干預(yù)后，晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）在皮膚組織中的蓄積較少（P<0.01）;血漿H2O2、MDA含量顯著下降（P<0.05或P<0.01），血漿GSH含量上升（P<0.05）。結(jié)論?GinsenRg3可能通過抑制DM創(chuàng)面皮膚組織中的AGEs沉積，調(diào)節(jié)過強(qiáng)氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)DM大鼠創(chuàng)面愈合。

關(guān)鍵詞：糖尿病皮損;AGEs;氧化應(yīng)激;人參皂苷Rg3

中圖分類號：R285.5??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??文章編號：1007-2349（2019）12-0051-04

【Abstract】Objective： To study the mechanism of Ginsenoside Rg3 in promoting wound healing of diabetic mellitus （DM） skin. Methods： Male SD rats were randomly divided into model control group， positive drug group， Ginsenoside Rg3 low and high dose groups and normal control group. Four weeks after the intragastric administration， the above DM rats and normal rats were taken to prepare a refractory wound. On the 21st day after injury， the skin tissue of the wound edge was taken， the sugar content of the skin tissue was detected， and the expression of AGEs was detected by immunofluorescence staining. Plasma was collected and the related oxidative stress response indexes （H2O2， MDA， GSH） were determined. Results： Compared with those of the model group， the accumulation of advanced glycation end products （AGEs） in skin tissue was less after Ginsenoside Rg3 intervention （P<0.01）， plasma H2O2 and MDA levels were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01） and plasma GSH content increased （P<0.05）. Conclusion： GinsenRg3 may regulate excessive oxidative stress and accelerate wound healing in DM rats by inhibiting AGEs deposition in DM wound skin tissue.

【Key words】diabetic lesion， AGEs， oxidative stress， Ginsenoside Rg3

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）自發(fā)性皮膚損傷（如DM潰瘍、DM性水皰等）或外源性創(chuàng)傷所致皮膚創(chuàng)面難愈成為DM患者最常見、且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。其創(chuàng)面愈合不良是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)參加的病理過程，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。目前醫(yī)學(xué)雖能有效控制患者血糖，但尚缺乏安全、有效地加速DM性創(chuàng)面修復(fù)的積極措施和相關(guān)治療藥物[1]。

研究表明，DM人代謝障礙引起的皮膚中糖含量增高和晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end product，AGEs）沉積為特征的“微環(huán)境污染”可能是DM人皮膚創(chuàng)面難于愈合的關(guān)鍵始動(dòng)因素。AGEs作為DM代謝重構(gòu)的直接產(chǎn)物，一旦形成，則蓄積在血液循環(huán)和皮膚、肝臟等組織及臟器中，與其受體（RAGE）相互作用后引起氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）反應(yīng)。抗氧化酶糖基化，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶活性降低，過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）谷胱甘肽（GSH）等氧化及抗氧化因子表達(dá)異常[2]，細(xì)胞氧化和抗氧化狀態(tài)失衡，產(chǎn)生過多活性氧族（又稱氧自由基，reactive oxygen species，ROS），進(jìn)而增加了白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細(xì)胞間黏附分子-I（ICAM-I）、血管細(xì)胞黏附分子-I（VCAM-I）等的表達(dá)，使細(xì)胞長期處于炎癥狀態(tài)，加重皮膚炎性反應(yīng)，最終造成皮損難于修復(fù)[3]。

前期研究證實(shí)，天然藥物 Ginsenoside Rg3，能促進(jìn)DM大鼠難愈創(chuàng)面模型的皮損修復(fù)且愈合良好，有效縮短愈合時(shí)間、提高創(chuàng)面愈合率[4]，作用機(jī)理有待深入探索。本研究擬在前期藥效基礎(chǔ)上研究Ginsenoside Rg3對DM皮膚損傷大鼠“微環(huán)境污染”（皮膚組織糖含量及AGEs表達(dá)）及相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，為該物質(zhì)修復(fù)DM難愈創(chuàng)面的藥物深入研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料

1.1?動(dòng)物?SPF級雄性SD大鼠，體重200±20 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-001，動(dòng)物合格證號：50218400001739，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.2?藥物及試劑?Ginsenoside Rg3（中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)研究室提供），氨基胍（aminoguanidirig，AG，昆明市泉港生物科技有限公司），鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，美國Sigma公司），0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（Solarbio，產(chǎn)品批號：20180712），戊巴比妥鈉（產(chǎn)品批號：20180329），磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS），DAPI（4，6-diamino-2-2phenylindole），抗熒光淬滅封片液，檸檬酸鹽緩沖液，石蠟，胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS），抗體稀釋液（0.1%TWeen-20，5%的BSA加入10 mL TBS中），封閉液（0.1%TWeen-20，5%的脫脂奶粉溶于10 mL TBS中），抗原修復(fù)液（索萊寶公司的檸檬酸鹽粉末加蒸餾水至2 L），異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），AGEs，抗兔源alexa fluo 488二抗。

2?方法

2.1?建立動(dòng)物模型[5]及實(shí)驗(yàn)分組?DM模型：高脂飼料喂養(yǎng)4周，大鼠禁食不禁水14 h后腹腔注射STZ 35 mg/kg。正常對照組腹腔注射等體積的0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液。于STZ注射后3天、7天測定空腹血糖（FBG），三次FBG≧16.7 mmol/L并伴隨出現(xiàn)三高一少癥狀為造模成功。將DM大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、陽性藥組、Rg3高、低劑量組，另設(shè)正常組。Rg3組分別灌胃Rg3 15、5 mg/kg，陽性藥組灌胃AG10 mg/kg，模型組、正常組給予等劑量生理鹽水，每天1次。（AG為目前已經(jīng)最多的AGEs抑制劑，故選為實(shí)驗(yàn)用陽性對照藥。）

皮膚損傷模型：給藥4周后，各組動(dòng)物以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，背部剃毛，常規(guī)消毒，用自制的無菌的2×2 cm2圓形硬紙片在脫去毛的皮膚上作好標(biāo)記，碘伏消毒，無菌剪刀在背部標(biāo)記處全層皮膚切除，勿傷及皮下的筋膜，如有出血，用無菌棉簽輕輕壓迫止血，單層生理鹽水紗布濕敷，外加蓋兩層消毒干紗布，膠布“豐”字型固定。手術(shù)前1天起，每只大鼠連續(xù)4d肌肉注射青霉素（4000 U/只），預(yù)防感染。待大鼠麻醉清醒后單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)水飲食。后續(xù)各實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)給藥直至取材。

2.2?檢測指標(biāo)及方法

2.2.1?標(biāo)本采集?傷后21 d，每組大鼠斷頸處死，取新鮮創(chuàng)緣皮膚組織，部分自動(dòng)生化分析儀檢測皮膚組織糖含量;部分4%多聚甲醛固定后制成石蠟塊保存，切片和貼片后免疫熒光染色法檢測AGEs表達(dá);肝素抗凝全血收集血漿，用于測定相關(guān)氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)（H2O2、MDA、GSH）。

2.2.2?皮膚組織糖含量?取凍存皮膚組織塊，稱質(zhì)量（約0.2 g），冰浴下剪碎，加入預(yù)冷的0.24 mol/L Ba（OH）2的溶液1.5 mL，勻漿，離心半徑14 cm，3000 r/min，離心10 min，上清液計(jì)量后，Beckman's生化自動(dòng)分析儀檢測糖濃度。按照下列公式計(jì)算皮膚糖含量：每克皮膚糖含量（mg/g皮膚）=[上清液體積（mL）×糖濃度（mmol/L）×180]÷皮膚組織塊濕量（g）×10-3。

2.2.3?AGEs表達(dá)檢測?包埋好的石蠟塊進(jìn)行切片和貼片處理后再免疫熒光染色。先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。對應(yīng)AGEs的二抗用異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記。用熒光顯微鏡激發(fā)后顯示綠色。從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量，最終用于觀察AGEs在皮膚中的表達(dá)情況。

2.2.4?氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)檢測?H2O2、MDA、GSH分別用南京建成公司提供的H2O2分光光度法試劑盒、MDA TBA法試劑盒、還原型GSH微量酶標(biāo)法試劑盒進(jìn)行檢測，具體操作參照說明書進(jìn)行。

2.2.5?統(tǒng)計(jì)分析?采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以表示，單因素方差分析、t檢驗(yàn)比較各組間差異。

3?結(jié)果

3.1?大鼠皮膚組織糖含量?與正常組比較，模型組中皮膚糖含量顯著升高，且與血糖水平呈正相關(guān)（r=0.57，P<0.01）。陽性組與模型組比較，含糖量無顯著變化（P>0.05）。GinsenRg3高、低劑組與模型組比較，糖含量均無顯著變化（P>0.05）。見表1。

3.2?對大鼠皮膚組織AGEs表達(dá)的影響?通過免疫熒光染色及定量技術(shù)測定含量可知，與正常組比較，模型組AGEs表達(dá)量明顯升高（P<0.01）;與模型對照組比較，陽性組可抑制AGEs的形成（P<0.05），GinsenRg3高、低劑組AGEs在皮膚中的表達(dá)量則顯著減少，（P<0.01）。見表2和圖1。

3.3?氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)的檢測?模型組血漿H2O2、MDA含量較正常組顯著上升（P<0.05 or P<0.05）;與模型組比較，經(jīng)陽性藥及GinsenRg3干預(yù)后，H2O2、MDA均下降（P<0.05 or P<0.05）。

模型組血漿GSH含量較正常組顯著下降（P<0.01）;與模型組比較，陽性組及GinsenRg3高、低劑量組則明顯上升（P<0.05）。見表3。

4?討論

DM皮膚創(chuàng)面難愈發(fā)病率高、病程長、病情復(fù)雜且易反復(fù)、治療方法局限和相關(guān)預(yù)后較差。創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜、精密而有序的過程，DM傷口以創(chuàng)傷愈合過程的紊亂為特征[6]。皮膚局部糖含量增高及AGEs蓄積，作為DM代謝重構(gòu)的直接產(chǎn)物，是皮膚細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、生長因子改變而發(fā)生相應(yīng)“隱形損害”的重要環(huán)境介質(zhì)，通過改變皮膚微環(huán)境，始動(dòng)性地介導(dǎo)了DM皮膚發(fā)生一系列以組織學(xué)、細(xì)胞功能學(xué)改變?yōu)樘卣鞯摹半[形損害”。有關(guān)學(xué)者把DM代謝紊亂所致皮膚組織中含糖量增高和AGEs蓄積引發(fā)的皮膚微環(huán)境改變，稱之為“微環(huán)境污染”。AGEs蓄積有關(guān)的許多生物途徑能導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，故存在H2O2、GSH、MDA等氧化及抗氧化因子異常表達(dá)[7]，而后者以及由此產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用直接參與了DM創(chuàng)面難愈的發(fā)生。

本研究中，經(jīng)GinsenRg3干預(yù)后，皮膚組織糖含量與模型組比較，差異無顯著性意義，表明藥物干預(yù)后未能降低DM皮膚組織糖含量，提示GinsenRg3組可能不是通過影響糖代謝促進(jìn)DM創(chuàng)面愈合的。AGEs在皮膚中的表達(dá)明顯的減少，有利于創(chuàng)面的修復(fù)，表明GinsenRg3對以糖尿病性皮膚組織中AGEs沉積為特征的“微環(huán)境污染”所介導(dǎo)的創(chuàng)面難愈有改善作用，為其重要作用機(jī)理之一。

另外，模型組血漿H2O2、MDA含量較正常組顯著上升，而GSH水平明顯下降，表明DM性皮損中存在氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)現(xiàn)象，是導(dǎo)致最終創(chuàng)面難愈重要因素。GinsenRg3高、低劑量組，較模型組H2O2、MDA降低，GSH則升高。表明GinsenRg3可改善由AGEs沉積所致的氧化應(yīng)激狀態(tài)，調(diào)節(jié)皮膚組織氧化與抗氧化平衡，為其修復(fù)DM難愈創(chuàng)面作用機(jī)理之一。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)GinsenRg3可能通過抑制DM創(chuàng)面皮膚組織中的AGEs沉積，調(diào)節(jié)過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)DM大鼠創(chuàng)面愈合，與前期藥效研究結(jié)果一致，部分證實(shí)了該藥物在修復(fù)DM皮膚損傷方面的作用機(jī)理。

參考文獻(xiàn)：

[1]Takahashi PY，Kiemele LJ，Chandra A，et al.A retrospective cohort study of factors that affect healing in long-term care residents with chronic wounds.Ostomy Wound Manage，2011，55（1）：32-37.

[2]S.Y.Goh，M.E.Cooper，Clinical review：The role of advanced glycation end products in progression and complication of diabetes[J].Clin Endocrinol Metab，2008，（93）：1143-1152.

[3]Ferdinando G，Michael B.Oxidative stress and diabetic complications[J].Circ Res，2010，（107）：1058-1062.

[4]李靜平，鄭永仁，張燕.人參皂苷Rg3對糖尿病大鼠創(chuàng)面修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.云南中醫(yī)中藥雜志[J].2016，37（1）：25-28.

[5]Zhang Y，Xing W，Huang H.Establisment of a non-contractile refractory wound model in type 2 diabetic rats[J].Chin J Tissue Eng Res，2012，16（24）：4432-4436.

[6]Breitbart AS，Laster J，Parrett B，et al.Acceler-ated diabetic wound healing using cultured dermal fibroblasts retro-vivally transduced with the platelet-derived growth factor B gene[J].Plastic Surgery，2013，54（4）：409-414.

[7]Drge W.Free radicals in the physiological control of cell function[J].PhysiolRev，2012，82（1）：47-95.

（收稿日期：2019-09-16）