人參皂苷Rg3對糖尿病皮膚損傷的AGEs表達及氧化應激反應的影響

起榮林 柯瑾 李靜平

摘要：目的?探討人參皂苷Rg3（Ginsenoside Rg3）促進糖尿病（DM）皮膚創面愈合的作用機理。方法?雄性SD大鼠制備DM模型，隨機分為模型對照組、陽性藥組、Ginsenoside Rg3低、高劑量組，另設正常對照組。灌胃給藥4周后，取上述DM大鼠和正常大鼠，制備難愈創面。傷后21d，取創緣皮膚組織，檢測皮膚組織糖含量、免疫熒光染色檢測AGEs表達;收集血漿，測定相關氧化應激反應指標（H2O2、MDA、GSH）。結果?與模型組比較，Ginsenoside Rg3干預后，晚期糖基化終末產物（AGEs）在皮膚組織中的蓄積較少（P<0.01）;血漿H2O2、MDA含量顯著下降（P<0.05或P<0.01），血漿GSH含量上升（P<0.05）。結論?GinsenRg3可能通過抑制DM創面皮膚組織中的AGEs沉積，調節過強氧化應激狀態，促進DM大鼠創面愈合。

關鍵詞：糖尿病皮損;AGEs;氧化應激;人參皂苷Rg3

中圖分類號：R285.5??文獻標志碼：A??文章編號：1007-2349（2019）12-0051-04

【Abstract】Objective： To study the mechanism of Ginsenoside Rg3 in promoting wound healing of diabetic mellitus （DM） skin. Methods： Male SD rats were randomly divided into model control group， positive drug group， Ginsenoside Rg3 low and high dose groups and normal control group. Four weeks after the intragastric administration， the above DM rats and normal rats were taken to prepare a refractory wound. On the 21st day after injury， the skin tissue of the wound edge was taken， the sugar content of the skin tissue was detected， and the expression of AGEs was detected by immunofluorescence staining. Plasma was collected and the related oxidative stress response indexes （H2O2， MDA， GSH） were determined. Results： Compared with those of the model group， the accumulation of advanced glycation end products （AGEs） in skin tissue was less after Ginsenoside Rg3 intervention （P<0.01）， plasma H2O2 and MDA levels were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01） and plasma GSH content increased （P<0.05）. Conclusion： GinsenRg3 may regulate excessive oxidative stress and accelerate wound healing in DM rats by inhibiting AGEs deposition in DM wound skin tissue.

【Key words】diabetic lesion， AGEs， oxidative stress， Ginsenoside Rg3

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）自發性皮膚損傷（如DM潰瘍、DM性水皰等）或外源性創傷所致皮膚創面難愈成為DM患者最常見、且嚴重的并發癥之一。其創面愈合不良是一個多因素、多環節參加的病理過程，發病機制復雜。目前醫學雖能有效控制患者血糖，但尚缺乏安全、有效地加速DM性創面修復的積極措施和相關治療藥物[1]。

研究表明，DM人代謝障礙引起的皮膚中糖含量增高和晚期糖基化終末產物（Advanced glycation end product，AGEs）沉積為特征的“微環境污染”可能是DM人皮膚創面難于愈合的關鍵始動因素。AGEs作為DM代謝重構的直接產物，一旦形成，則蓄積在血液循環和皮膚、肝臟等組織及臟器中，與其受體（RAGE）相互作用后引起氧化應激（oxidative stress，OS）反應。抗氧化酶糖基化，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶活性降低，過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）谷胱甘肽（GSH）等氧化及抗氧化因子表達異常[2]，細胞氧化和抗氧化狀態失衡，產生過多活性氧族（又稱氧自由基，reactive oxygen species，ROS），進而增加了白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細胞間黏附分子-I（ICAM-I）、血管細胞黏附分子-I（VCAM-I）等的表達，使細胞長期處于炎癥狀態，加重皮膚炎性反應，最終造成皮損難于修復[3]。

前期研究證實，天然藥物 Ginsenoside Rg3，能促進DM大鼠難愈創面模型的皮損修復且愈合良好，有效縮短愈合時間、提高創面愈合率[4]，作用機理有待深入探索。本研究擬在前期藥效基礎上研究Ginsenoside Rg3對DM皮膚損傷大鼠“微環境污染”（皮膚組織糖含量及AGEs表達）及相關氧化應激反應的影響，為該物質修復DM難愈創面的藥物深入研發奠定理論基礎。

1?材料

1.1?動物?SPF級雄性SD大鼠，體重200±20 g，動物生產許可證號：SCXK（遼）2015-001，動物合格證號：50218400001739，購自遼寧長生生物技術股份有限公司。

1.2?藥物及試劑?Ginsenoside Rg3（中國科學院昆明植物研究所植物化學研究室提供），氨基胍（aminoguanidirig，AG，昆明市泉港生物科技有限公司），鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，美國Sigma公司），0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（Solarbio，產品批號：20180712），戊巴比妥鈉（產品批號：20180329），磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS），DAPI（4，6-diamino-2-2phenylindole），抗熒光淬滅封片液，檸檬酸鹽緩沖液，石蠟，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS），抗體稀釋液（0.1%TWeen-20，5%的BSA加入10 mL TBS中），封閉液（0.1%TWeen-20，5%的脫脂奶粉溶于10 mL TBS中），抗原修復液（索萊寶公司的檸檬酸鹽粉末加蒸餾水至2 L），異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，FITC），AGEs，抗兔源alexa fluo 488二抗。

2?方法

2.1?建立動物模型[5]及實驗分組?DM模型：高脂飼料喂養4周，大鼠禁食不禁水14 h后腹腔注射STZ 35 mg/kg。正常對照組腹腔注射等體積的0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液。于STZ注射后3天、7天測定空腹血糖（FBG），三次FBG≧16.7 mmol/L并伴隨出現三高一少癥狀為造模成功。將DM大鼠隨機分為4組：模型組、陽性藥組、Rg3高、低劑量組，另設正常組。Rg3組分別灌胃Rg3 15、5 mg/kg，陽性藥組灌胃AG10 mg/kg，模型組、正常組給予等劑量生理鹽水，每天1次。（AG為目前已經最多的AGEs抑制劑，故選為實驗用陽性對照藥。）

皮膚損傷模型：給藥4周后，各組動物以戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，背部剃毛，常規消毒，用自制的無菌的2×2 cm2圓形硬紙片在脫去毛的皮膚上作好標記，碘伏消毒，無菌剪刀在背部標記處全層皮膚切除，勿傷及皮下的筋膜，如有出血，用無菌棉簽輕輕壓迫止血，單層生理鹽水紗布濕敷，外加蓋兩層消毒干紗布，膠布“豐”字型固定。手術前1天起，每只大鼠連續4d肌肉注射青霉素（4000 U/只），預防感染。待大鼠麻醉清醒后單籠喂養，自由進水飲食。后續各實驗組繼續給藥直至取材。

2.2?檢測指標及方法

2.2.1?標本采集?傷后21 d，每組大鼠斷頸處死，取新鮮創緣皮膚組織，部分自動生化分析儀檢測皮膚組織糖含量;部分4%多聚甲醛固定后制成石蠟塊保存，切片和貼片后免疫熒光染色法檢測AGEs表達;肝素抗凝全血收集血漿，用于測定相關氧化應激反應指標（H2O2、MDA、GSH）。

2.2.2?皮膚組織糖含量?取凍存皮膚組織塊，稱質量（約0.2 g），冰浴下剪碎，加入預冷的0.24 mol/L Ba（OH）2的溶液1.5 mL，勻漿，離心半徑14 cm，3000 r/min，離心10 min，上清液計量后，Beckman's生化自動分析儀檢測糖濃度。按照下列公式計算皮膚糖含量：每克皮膚糖含量（mg/g皮膚）=[上清液體積（mL）×糖濃度（mmol/L）×180]÷皮膚組織塊濕量（g）×10-3。

2.2.3?AGEs表達檢測?包埋好的石蠟塊進行切片和貼片處理后再免疫熒光染色。先用已知未標記的特異抗體（第一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗原—抗體—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。對應AGEs的二抗用異硫氰酸熒光素FITC標記。用熒光顯微鏡激發后顯示綠色。從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量，最終用于觀察AGEs在皮膚中的表達情況。

2.2.4?氧化應激反應指標檢測?H2O2、MDA、GSH分別用南京建成公司提供的H2O2分光光度法試劑盒、MDA TBA法試劑盒、還原型GSH微量酶標法試劑盒進行檢測，具體操作參照說明書進行。

2.2.5?統計分析?采用SPSS 19.0統計軟件，對數據進行統計分析。結果以表示，單因素方差分析、t檢驗比較各組間差異。

3?結果

3.1?大鼠皮膚組織糖含量?與正常組比較，模型組中皮膚糖含量顯著升高，且與血糖水平呈正相關（r=0.57，P<0.01）。陽性組與模型組比較，含糖量無顯著變化（P>0.05）。GinsenRg3高、低劑組與模型組比較，糖含量均無顯著變化（P>0.05）。見表1。

3.2?對大鼠皮膚組織AGEs表達的影響?通過免疫熒光染色及定量技術測定含量可知，與正常組比較，模型組AGEs表達量明顯升高（P<0.01）;與模型對照組比較，陽性組可抑制AGEs的形成（P<0.05），GinsenRg3高、低劑組AGEs在皮膚中的表達量則顯著減少，（P<0.01）。見表2和圖1。

3.3?氧化應激反應指標的檢測?模型組血漿H2O2、MDA含量較正常組顯著上升（P<0.05 or P<0.05）;與模型組比較，經陽性藥及GinsenRg3干預后，H2O2、MDA均下降（P<0.05 or P<0.05）。

模型組血漿GSH含量較正常組顯著下降（P<0.01）;與模型組比較，陽性組及GinsenRg3高、低劑量組則明顯上升（P<0.05）。見表3。

4?討論

DM皮膚創面難愈發病率高、病程長、病情復雜且易反復、治療方法局限和相關預后較差。創面愈合是一個復雜、精密而有序的過程，DM傷口以創傷愈合過程的紊亂為特征[6]。皮膚局部糖含量增高及AGEs蓄積，作為DM代謝重構的直接產物，是皮膚細胞、細胞外基質、生長因子改變而發生相應“隱形損害”的重要環境介質，通過改變皮膚微環境，始動性地介導了DM皮膚發生一系列以組織學、細胞功能學改變為特征的“隱形損害”。有關學者把DM代謝紊亂所致皮膚組織中含糖量增高和AGEs蓄積引發的皮膚微環境改變，稱之為“微環境污染”。AGEs蓄積有關的許多生物途徑能導致氧化應激的發生，故存在H2O2、GSH、MDA等氧化及抗氧化因子異常表達[7]，而后者以及由此產生的細胞毒性作用直接參與了DM創面難愈的發生。

本研究中，經GinsenRg3干預后，皮膚組織糖含量與模型組比較，差異無顯著性意義，表明藥物干預后未能降低DM皮膚組織糖含量，提示GinsenRg3組可能不是通過影響糖代謝促進DM創面愈合的。AGEs在皮膚中的表達明顯的減少，有利于創面的修復，表明GinsenRg3對以糖尿病性皮膚組織中AGEs沉積為特征的“微環境污染”所介導的創面難愈有改善作用，為其重要作用機理之一。

另外，模型組血漿H2O2、MDA含量較正常組顯著上升，而GSH水平明顯下降，表明DM性皮損中存在氧化應激反應增強現象，是導致最終創面難愈重要因素。GinsenRg3高、低劑量組，較模型組H2O2、MDA降低，GSH則升高。表明GinsenRg3可改善由AGEs沉積所致的氧化應激狀態，調節皮膚組織氧化與抗氧化平衡，為其修復DM難愈創面作用機理之一。

綜上所述，實驗結果證實GinsenRg3可能通過抑制DM創面皮膚組織中的AGEs沉積，調節過度的氧化應激反應，促進DM大鼠創面愈合，與前期藥效研究結果一致，部分證實了該藥物在修復DM皮膚損傷方面的作用機理。

參考文獻：

[1]Takahashi PY，Kiemele LJ，Chandra A，et al.A retrospective cohort study of factors that affect healing in long-term care residents with chronic wounds.Ostomy Wound Manage，2011，55（1）：32-37.

[2]S.Y.Goh，M.E.Cooper，Clinical review：The role of advanced glycation end products in progression and complication of diabetes[J].Clin Endocrinol Metab，2008，（93）：1143-1152.

[3]Ferdinando G，Michael B.Oxidative stress and diabetic complications[J].Circ Res，2010，（107）：1058-1062.

[4]李靜平，鄭永仁，張燕.人參皂苷Rg3對糖尿病大鼠創面修復作用的實驗研究.云南中醫中藥雜志[J].2016，37（1）：25-28.

[5]Zhang Y，Xing W，Huang H.Establisment of a non-contractile refractory wound model in type 2 diabetic rats[J].Chin J Tissue Eng Res，2012，16（24）：4432-4436.

[6]Breitbart AS，Laster J，Parrett B，et al.Acceler-ated diabetic wound healing using cultured dermal fibroblasts retro-vivally transduced with the platelet-derived growth factor B gene[J].Plastic Surgery，2013，54（4）：409-414.

[7]Drge W.Free radicals in the physiological control of cell function[J].PhysiolRev，2012，82（1）：47-95.

（收稿日期：2019-09-16）