地米樟酚乳膏微生物限度檢查方法的驗證

彭賢東 ，龍 鳳 ，唐志立 ，劉 崢

(1.四川省南充市中心醫院藥學部，四川 南充 637000; 2.四川省藥品質量研究所，四川 成都 610036)

地米樟酚乳膏是我院使用多年的醫院自制制劑，臨床用于治療局限性瘙癢癥、濕疹、皮炎等各種變應性皮膚病。為更好地控制與完善制劑質量，配合醫院制劑注冊申報，筆者參考文獻[1－3]對該制劑的微生物限度檢查方法進行了驗證，并獲得制劑批準文號(川藥制字H20101001)。現將其微生物限度檢查方法驗證報道如下。

1 儀器與材料

DC82型隔水式電熱恒溫培養箱(上海南匯老港機械廠);LRH－150B型生化培養箱(韶關市泰宏醫療器械有限公司)。地米樟酚乳膏(南充市中心醫院自制，批號為100216，規格為每10 g含醋酸地塞米松5 mg、樟腦0.25 g與苯酚0.1 g);5%聚山梨酯80－pH 7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液按文獻[1]進行制備，高壓蒸汽滅菌法滅菌，作為稀釋液。營養肉湯培養基(批號為081103);改良馬丁培養基(批號為080424);改良馬丁瓊脂培養基(批號為080911);營養瓊脂培養基(批號為0810163);玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號為0810233);膽鹽乳糖培養基(批號為081215)，均由中國藥品生物制品檢定所提供。大腸埃希菌[CMCC(B)44102];金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003];銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104];枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501];白色念珠菌[CMCC(F)98001];黑曲霉[CMCC(F)98003]均為第3代，由四川省藥品質量研究所提供。

2 方法與結果

2.1 菌液制備

取經35℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌以及銅綠假單胞菌的營養肉湯培養物1 mL，加入9mL 0.9% 氯化鈉注射液 10 倍稀釋至 10－5～10－7，菌落數約為50～100 cfu/mL，作活菌液計數備用。取經25℃培養24～48 h的白色念珠菌的改良馬丁培養基1mL，加入9mL0.9%氯化鈉注射液 10 倍稀釋至 10－5～10－6，菌落數約為 50 ～100 cfu/mL，作活菌液計數備用。取經25℃培養1周的黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養物，加3～5mL0.9%氯化鈉注射液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取1mL加9mL 0.9%氯化鈉注射液，逐管10倍稀釋為10－5，菌落數約為50～100cfu/mL，做活菌液計數備用。

2.2 供試品溶液制備

本品為乳膏劑，加入pH 7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液中固體不能均勻分散。根據文獻[1]取本品10 g，加45℃的5%聚山梨酯80－pH 7.0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，在45℃水浴中放置約20 min，并不時振搖使其分散均勻，制成1∶10供試品溶液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

2.3.1 平皿法

分別取1∶10供試品溶液1mL/皿，分別同時加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉各1mL。其中三種細菌用營養瓊脂培養基培養，白色念珠菌和黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養基培養。各平行制備兩皿。分別置規定溫度培養、觀察。試驗結果見表1。大腸埃希菌回收率高于70%，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率均低于70%。該品種有抑菌作用，不能采用平皿法進行菌落計數。

表1 平皿法計數回收率測定

2.3.2 培養基稀釋法

取1∶10供試品溶液，按0.2mL/皿加入平皿，分別同時加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉各1mL。各平行制備兩皿，進行3次獨立平行試驗。分別置規定溫度培養、觀察。結果見表2。可見，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌回收率均高于70%，說明此方法可消除本品對細菌的抑菌作用，細菌計數可用此方法。黑曲霉的回收率低于70%，不能消除對黑曲霉的抑菌作用。取1∶10供試品溶液，按0.1mL/皿加入平皿，分別同時加入金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉各1mL。各平行制備兩皿，進行3次獨立平行試驗。分別置規定溫度培養、觀察。結果見表3。可見，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均大于70%，此方法可消除本品對霉菌的抑菌作用，可按該方法進行霉菌及酵母菌的計數，與文獻[4－5]報道的方法一致。

表2 培養基稀釋法(0.2mL/皿)計數回收率

表3 培養基稀釋法(0.1mL/皿)計數回收率

2.3.3 回收率計算

試驗組:按上述各方法分別取供試品溶液與50～100 cfu/mL試驗菌數，同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72 h，觀察結果。菌液組:測定每一菌株加的試驗菌數(cfu/mL)。供試品溶液對照:按上述各方法分別取供試品溶液，加入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養24～72 h，觀察結果。試驗組的菌回收率=[(試驗組的平均菌落數－供試品溶液對照組的平均菌落數)/菌液組的平均菌落數]×100%;

2.4 控制菌檢查法驗證

金黃色葡萄球菌:取1∶10供試品溶液10mL，分別接種至3瓶200 mL營養肉湯培養基中，其中1瓶加入1mL金黃色葡萄球菌(10～100個/mL)為陽性菌對照，1瓶加入1mL大腸埃希菌(10～100個/mL)為陰性菌對照，按金黃色葡萄球菌常規檢查法檢驗。結果見表4。可見，陽性菌對照中檢出金黃色葡萄球菌，陰性菌對照未檢出金黃色葡萄球菌，表明本品的金黃色葡萄球菌檢查可按常規方法。

表4 金黃色葡萄球菌常規法檢查結果

銅綠假單胞菌檢查:取1∶10供試品溶液10mL，分別接種至3瓶100mL膽鹽乳糖培養基中，其中1瓶加入1mL銅綠假單胞菌(10～100個/mL)為陽性菌對照，1瓶加入1mL金黃色葡萄球菌(10～100個/mL)為陰性菌對照，按銅綠假單胞菌檢查法檢驗，結果見表5。可見，陽性菌對照中檢出銅綠假單胞菌，陰性菌對照未檢出銅綠假單胞菌，表明采用常規法可進行本品的銅綠假單胞菌檢查。

表5 銅綠假單胞菌常規法檢查結果

3 討論

對地米樟酚乳膏中含有的抑菌成分進行微生物限度檢查時，要求供試品自身在試驗條件下能有效地排除其抑菌作用。根據文獻規定[1]，細菌計數、霉菌和酵母菌計數方法驗證的回收率應不低于70%。由本驗證結果表明，所建立的微生物限度檢查方法可用于地米樟酚乳膏微生物限度檢查，消除本品抑菌活性對試驗的干擾。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學工業出版社，2010:附錄 107－116.

[2]蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術[M].北京:華齡出版社，2007:209－227.

[3]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京:中國醫藥科技出版社，2010:351－407.

[4]王亞南，魏立平，張潤婕，等.含苯酚制劑的微生物限度檢測方法的驗證 [J].中國藥房，2007，18(28):2 217－2 219.

[5]別小琳，王 燦.復方樟腦乳膏微生物限度檢查方法的建立[J].四川生理科學雜志，2010，32(3):106 －108.