FMR1基因CGG重復序列多態性與不明原因早期自然流產的相關性研究

馮旺琴，陳素文*，武淑英，陳雁鳴

(1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院計劃生育科，北京 100026；2. 北京大學第三醫院婦產科，北京 100083)

流產分為早期流產和晚期流產，在所有臨床確認的妊娠中，約10%～15%會發生早期自然流產[1]。自然流產的病因較復雜，包括內分泌功能異常、解剖學因素、遺傳學因素、免疫學因素、感染性疾病、父母雙方高齡及其他未知因素[2]。近年來，自然流產的發病率逐年升高，嚴重影響了女性的生殖健康和心理健康，其具體發病機制仍不十分清楚，目前認為遺傳因素在其中發揮了重要作用[3]。脆性X智力障礙1號基因(FMR1)的5’端非編碼區有一個不穩定的CGG三核苷酸串聯重復序列，該基因又稱家族性智力低下基因，位于染色體Xq27.3處，1991年由荷蘭科學家Verkerk等[4]發現，當FMR1基因5’端非編碼區CGG重復序列異常擴增時，其蛋白產物FMRP(主要在大腦和睪丸組織中表達)顯著減少，當擴增達到200 bp以上，往往伴隨著超甲基化，最終使得新生兒缺乏FMRP，引起智力障礙[5]。

國內外不同種族人群FMR1基因CGG重復序列多態性存在差異，我國尚未見到該基因大樣本育齡女性的數據。自然流產夫婦FMR1基因CGG重復序列多態性是否高于普通人群，需要進一步研究。本研究通過回顧性分析探討不明原因早期自然流產與FMR1基因CGG重復序列多態性變異程度之間的關系，為自然流產的病因學研究及臨床診療提供參考，也為自然流產患者再次妊娠前進行遺傳咨詢提供指導。

資料與方法

一、研究對象

研究對象包括自然流產組與對照組。

收集2015年5月1日至2018年4月1日期間在首都醫科大學附屬北京婦產醫院計劃生育科就診的患者，難免流產或超聲檢查發現胚胎停育(未見胎心搏動、無胚芽等)需要清宮終止妊娠的孕婦，一共2 000例，為自然流產組，發生1次及1次以上不明原因的自然流產，年齡20～46歲。排除標準：生殖道畸形、全身性感染、外力撞擊、負重等因素。

收集同期在北京婦產醫院產科就診的1 480例順利分娩正常新生兒的女性為對照組，年齡23～45歲。

自然流產組和對照組均為漢族。所有研究對象均自愿進行該項檢查，并簽署知情同意書。

二、實驗方法

所有研究對象于孕早期或孕中期進行FMR1基因檢測。抽取研究對象外周靜脈血2 ml，以Magen全血DNA提取試劑盒(Magen，美國)提取基因組DNA，利用脆性X-FMR1基因Amplide X檢測技術(Asuragen，美國)進行CGG重復序列數檢測。反應體系為三引物(FMR1上、下游引物、上游CGG引物各0.5 μl)進行PCR擴增，擴增條件按試劑盒說明書要求設置。

詳細記錄本實驗所有研究對象的各項資料，結合FMR1基因突變篩查所得結果，對相關數據以及研究對象的各種臨床資料進行比較分析。采用目前國內外普遍采用的分類：(1)正常重復范圍(n=5～44次)；(2)中間型(intermediate)或者灰區(gray zone)(n=45～54次)；(3)前突變(premutation)(n=55～200次)；(4)全突變(full mutation)(n>200次)[6]。

三、統計學方法

結 果

一、患者一般情況比較

自然流產組孕周5～12周，平均(8.6±2.2)周。其中孕周<9周的1 035例，孕周≥9周的965例。初次自然流產1 337例，復發性流產(流產次數≥2次)663例。孕次1～6次，產次0～1次。孕婦年齡>35歲998例，年齡≤35歲1 002例，平均年齡(31.5±3.3)歲。

對照組平均年齡(30.8±3.2)歲，孕次1～7次，產次1～3次；孕婦年齡>35歲678例，年齡≤35歲802例。兩組病例年齡比較無統計學差異(P>0.05)。

二、兩組CGG重復序列分布規律比較

自然流產組患者FMR1基因檢測及統計結果顯示：CGG重復最大頻率等位基因n=30，其次為29，再其次為36和31。對照組最大頻率等位基因n=30，其次依次是29、36和31，兩者高度一致。自然流產組檢測到35種不同的等位基因，CGG重復次數變異范圍n=21～133，最大頻率等位基因為n=30(659/2 000，32.95%)，其后依次是n=29(623/2 000，31.15%)、36(312/2 000，15.60%)、31(117/2 000，5.85%)。對照組檢測得到25種不同的等位基因，CGG重復次數變異范圍n=22～58，最大頻率等位基因n=30(492/1 480，33.24%)，其后依次是n=29(377/1 480，25.47%)、36(218/1 480，14.73%)、31(124/1 480，8.38%)。自然流產組及對照組CGG重復均數分別為(29.33±5.19)、(28.73±6.37)次，二者比較差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組FMR1基因CGG重復序列分布比較[n(%)]

本研究將中間型(灰色區域)CGG重復次數擴增范圍定為45～54，檢出自然流產組FMR1基因的中間型患者9例，FMR1基因中間型攜帶率為1∶222；對照組中FMR1基因的中間型6例，FMR1基因中間型攜帶率為1∶247。二者比較差異無統計學意義(P>0.05)。

自然流產組中FMR1基因前突變(PM)攜帶者5例，攜帶者的頻率1∶400。對照組中前突變攜帶者2例，攜帶者的頻率1∶740。二者比較差異有統計學意義(P<0.05)。

所有病例均未發現FMR1全突變基因(>200 CGG)。

討 論

自然流產是一種較為常見的妊娠并發癥，可能與染色體異常、免疫因素、遺傳因素等有關，但臨床上仍有約50%的患者病因不明確。

脆性X綜合征，是一種常見的遺傳性智力低下疾病，其致病基因為脆性智力障礙基因。FMR1基因CGG重復次數的變化與臨床意義緊密相關，根據不同的擴增概率，目前國內外普遍采用美國醫學遺傳學和基因組學學會的建議，將CGG重復序列分為4類，第1類“正?！?，表明未受累型，CGG重復數5～44之間，一般情況下未受累人群傳代過程中CGG重復序列穩定，其后代不會因為CGG擴增的原因導致脆性X綜合征，因此受檢者不必進行產前診斷[3]；第2類中間區域，或者“灰區”，重復數45～54次之間，受檢者本身沒有臨床癥狀，其后代也不會因為CGG的擴增導致脆性X綜合征，可不建議進行產前診斷，但后代有可能擴增成為攜帶者，可以檢測其后代的FMR1基因；第3類，“前突變”序列，55～200次之間，即突變攜帶者，后代有很大的擴增風險，因此需要進行產前診斷和遺傳咨詢；第4類，“全突變”序列，CGG重復數>200次，為完全突變型，大約50%的女性為脆性X綜合征患者，50%可能沒有癥狀，需要進行產前診斷[6-8]。

本研究樣本發現，自然流產組和對照組頻率最高的CGG重復數都是30、29，其次為36、31。國內張有成等[9]報道頻率最高的CGG重復數是29個CGG重復，其次為30和31個CGG重復，再其次為36和37個CGG重復。與本研究高度一致。巫向前等[10]報道FMR1等位基因在漢族人群中沒有區域差異，最常見的重復數為29，其次為36。劉帆等[11]研究報道烏魯木齊市漢族育齡女性的FMR1基因中最常見的CGG重復數為29(41.33%)，其次為30(28.06%)。馬云等[12]研究漢族和壯族人群的最大峰值分別為28和29，序列范圍為6～43，其中CGG重復序列范圍主要為27～30。本研究與國內報道基本相符。

自然流產組FMR1基因的灰色區域患者9例，FMR1基因灰色區域攜帶率為1∶222，對照組灰色區域攜帶者6例，攜帶率為1∶274，均為漢族育齡女性。劉帆等[11]報道烏魯木齊市漢族育齡女性FMR1基因突變灰色區域攜帶率為1∶98，高于本研究結果。自然流產組脆性X綜合征前突變攜帶者5例，攜帶者的頻率1∶400。Lu等[13]對122例卵巢早衰漢族女性進行檢測，前突變攜帶率1∶122，高于本研究病例。美國研究結果顯示FMR1基因CGG重復序列的女性全突變患病率報道范圍為1∶8 000到1∶2 500，中間型(n=45～54)發病率為1∶66，明顯高于本研究的1∶222和1∶247；前突變(n=55～200)的攜帶率為1∶113到1∶382[8，14-15]，與本研究自然流產組的1∶400接近，明顯高于本研究對照組的攜帶率1∶740。

中國臺灣地區、韓國開展了FMR1基因CGG重復序列檢測的相關研究。韓國進行的FMR1基因回顧性研究結果顯示前突變的患病率為1∶788，中間型(n=45～54次)的攜帶率為1∶137[16]，顯著低于西歐等其他國家的報道。也低于本研究自然流產組前突變的攜帶率，但與對照組基本一致。中國臺灣地區開展的脆性X綜合征相關新生兒篩查研究估計該地區的發病率為1∶10 046[17]，也明顯低于非亞洲地區的發病率報道。

研究發現，FMR1基因前突變與卵巢早衰之間具有顯著相關性，前突變患者卵巢早衰發病率高達13%，自然絕經時間較早，有關卵巢儲備功能相關的指標：血清抗苗勒管激素、基礎FSH水平等出現異常[18-19]。對于前突變攜帶者女性，建議進行遺傳咨詢，同時進行產前診斷，隨著年齡增長，卵巢儲備功能下降，絕經可能提前，卵細胞質量下降，導致妊娠丟失，推遲生育可能不是一個好的選擇[20-22]。美國婦產科學院建議存在風險的女性在40歲之前進行基因突變篩查，前突變攜帶者風險增高，需要評估卵巢儲備功能，如基礎竇卵泡數或者卵巢儲備功能，建議患者在卵巢功能下降之前懷孕，以避免妊娠的丟失。隨著目前我國二胎的全面開放，二胎生育年齡明顯推遲，高齡尤其40歲以上的女性希望生育二胎比例明顯增加，對我國高齡女性進行基因突變篩查同樣重要。

本研究發現自然流產組FMR1基因的前突變型攜帶比例顯著高于對照組，其原因尚不明確。提示FMR1基因CGG重復序列前突變與不明原因早期自然流產可能存在相關性。Kline等[23-24]曾推測流產的增加可能與卵巢卵母細胞池的減少有關，FMR1基因的前突變攜帶者，卵巢儲備功能下降，二者之間可能存在某種關聯。本試驗尚未對所有研究對象的卵巢儲備功能相關指標進行對比研究，后續研究需進一步完善。

對所篩查出的FMR1前突變基因攜帶者的臨床特點進行分析，發現5例患者有3例有2次自然流產史，2例1次自然流產史，等位基因n=62、70、81、83、133，均尚未分娩。對照組2例前突變攜帶者，分娩時年齡為29歲、32歲，等位基因均為n=58，其中1例第1次足月分娩，另1例為二胎，曾有1次人工流產史，均無不良孕產史，新生兒均正常。Strom等[25]進行了119 232例脆性X綜合征檢測和307例產前檢查，發現1.7%FMR1基因前突變，當胎兒遺傳了一個擴大的母體等位基因，對于<50、50～75、76～100、>100重復序列的等位基因，擴展到一個完整的受影響的等位基因的風險分別是0%、5%、30%和100%。這些數據有利于攜帶者的遺傳咨詢和脆性X綜合征的產前診斷。CGG重復區域內AGG插入位置和數量，被認為是在子代傳遞傳過程中，有利于減少擴增為全突變的可能性[26]。

女性攜帶者在傳代過程中易發生CGG重復序列的進一步擴展，發病風險呈逐代遞增趨勢。對于中間型的等位基因，在子代傳遞中的擴增風險尚缺乏有力依據，給孕婦或孕前的女性提供遺傳咨詢時，要考慮到在子代傳遞過程中重復序列的不穩定性。前突變患者應告知子代傳遞中有明確的擴增為全突變的風險，并根據風險概率向前突變攜帶者提供合理的生育建議[27]。對于攜帶者，進行產前風險評估做出合理的生育計劃，告知生育的可能性和途徑，獲得成功的生殖結局[28]。部分脆性X綜合征患者外周血中的CGG重復狀況不能取代其他組織中的情況，遺傳檢測和咨詢環節一定要注意FMR1基因CGG重復序列的組織異質性。檢測中應明確CGG重復數目、AGG插入模式和FMR1甲基化情況3個重要因素，以此評估個人致病風險及生殖傳遞過程中的風險。本研究僅對外周血CGG重復序列進行研究，有一定局限性，需要進一步完善。

本研究認為FMR1基因CGG重復序列位于中間型及以上的婦女應引起產前診斷及遺傳咨詢的足夠重視。Saul等[29]對美國南卡羅來納州出生后的1 459例新生兒進行了測試，獲得了5個異常結果，包括1個性染色體非整倍體(47，XXY)、2個前突變和2個全突變，脆性X綜合征檢測率為1∶730，對新生兒的篩查有潛在的可行性，但評估、人口效益尚不能用于常規篩查。Hill等[30]對新生兒和妊娠前或妊娠期間的育齡婦女進行脆性X綜合征的人群系統篩查，發現除了醫學問題，更要注意篩查者的心理問題和教育支持，避免過度的焦慮和失望。

后續我們仍需進行大規模的研究，了解中國育齡女性人群中FMR1基因突變的特點、其與臨床表型的關系以及對子代的影響，對其進行針對性的遺傳咨詢及指導，篩查潛在高危因素的孕婦，以提升脆性X綜合征的產前檢出率，達到優生優育。這些數據資料也為篩選中國人群中脆性X綜合征的患者和攜帶者提供了依據。