DNA甲基化在胃癌中的研究進展

杜迎新 綜 述 鄧靖宇，梁 寒 審 校

（天津醫科大學腫瘤醫院胃部腫瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060）

胃癌是消化系統最為常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中其發病率位居第四，死亡率居第二位[1]。相關研究機構的統計分析結果顯示全球每年有超過95萬新發胃癌病例，且年死亡病例超過72萬[2]，總體來說胃癌患者生存狀況不容樂觀。盡管近年來胃癌在全球范圍內總體發病率呈下降趨勢，但由于胃癌早期常缺乏相應特異性癥狀而延誤了其早期發現和治療。

胃癌發生和進展是由多因素、多基因參與，同時涉及多步驟的復雜過程。許多研究證實[3-5]胃癌發生和進展與表觀遺傳學密切相關。表觀遺傳學這一術語是由Waddington[6]于1939年首次提出，指的是非DNA序列改變所致基因表達發生可遺傳且可逆改變的現象，是基因與表型之間的因果交互作用。表觀遺傳特性改變促進癌癥發生的機制可能與某些信號通路激活或抑制有關，涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、遺傳印記、RNA調控、X染色體失活等方面。隨著表觀遺傳學發展和研究的不斷深入，DNA甲基化異常已成為胃癌研究中最為廣泛和深入的表觀遺傳機制，其與腫瘤的關系也已成為研究熱點。因此了解DNA甲基化相關知識及其與腫瘤尤其是胃癌之間的關系，胃癌相關基因甲基化異常的研究進展，DNA甲基化分子標志物的臨床意義以及去甲基化藥物的臨床應用就顯得尤為必要。

1 DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）是由S-腺苷蛋氨酸（SAM）提供甲基，經DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase,DNMT）催化，在CpG二核苷酸胞嘧啶殘基上添加甲基基團的共價修飾，是最常見的表觀遺傳現象。DNA甲基化參與了包括染色質重塑和基因表達調控等在內的重要生理過程，調節著真核生物中細胞周期、細胞增殖、分化、凋亡等眾多重要生命活動。DNA甲基化作用可以維持基因組穩定性，同時也可以降低因重復序列間同源重組造成的染色體缺失和重排，對維持細胞遺傳穩定具有重要作用。哺乳動物中已知的DNA甲基轉移酶包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b 和 DNMT3l 等5種，但能在甲基化過程中發揮甲基轉移酶活性的只有DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。其中DNMT1在整個甲基化過程中發揮著主導作用，維持著新生DNA復制鏈的甲基化模式。DNMT3a和DNMT3b被稱為從頭DNA甲基轉移酶，催化甲基基團向胞嘧啶轉移，參與早期甲基化形成。DNA甲基化是一個可逆過程，mbd2的小分子片段mbd2b是一種去甲基化酶，可作用于因甲基化而沉默的基因，使其重新恢復轉錄表達[7]。通常所說的CpG位點可分為兩種不同類型，其中一種稱為甲基化的CpG位點，其特點是CpG位點散在分布于DNA中，且甲基化率高達70%以上。另一種則存在于基因某些特定區域，常出現CpG二核苷酸較多地聚集于基因5′端啟動子區和（或）第一外顯子區，這些部位分子量＞500 bp，CG含量＞60%，且未被甲基化，這些CpG聚集區域稱為CpG島（CpG islands），超過50%人類基因啟動子區含有這一結構。

2 DNA甲基化異常與腫瘤

人類基因組中約70%～80%的CpG二核苷酸生理條件下呈甲基化狀態，而在基因CpG島區域則處于嚴格的非甲基化狀態。甲基化失衡時可出現基因組廣泛低甲基化和CpG島高甲基化共存，因基因空間結構改變而導致其表達紊亂，引起細胞增殖與分化異常。DNA低甲基化可通過其誘導產生的內源性逆轉錄病毒物質或通過表觀遺傳效應而激活ras、myc等原癌基因從而參與腫瘤發生[8]，但其在腫瘤發生中的具體作用機制尚未明確。另有學者認為DNA低甲基化還可導致基因組不穩定和突變率增加，并促進雜合性缺失而誘發腫瘤[9]。研究者在對腫瘤進一步研究中還發現除了整個基因組中出現普遍性低甲基化，還伴隨著特定基因啟動子區高甲基化現象。與DNA低甲基化相比，CpG島區域高甲基化在腫瘤中更為常見，與腫瘤發生、進展的關系也更為密切。抑癌基因高甲基化是除基因突變和基因缺失外第三種致使基因失活的分子機制，其甲基化程度與基因表達水平呈負相關，被認為是致使抑癌基因轉錄沉默的關鍵途徑之一。DNA高甲基化導致腫瘤發生、進展的可能作用機制簡單概括如下：（1）發生于啟動子的甲基化異常會造成某些轉錄因子與其特異性識別位點結合受阻，進而影響到癌基因或抑癌基因的轉錄調控，即DNA甲基化抑制基因表達的直接方式。但由于轉錄因子結合的DNA序列并非都含有CpG二核苷酸，故該機制并不具有普遍性；（2）DNA甲基化轉移酶可通過染色質重構抑制基因轉錄；（3）甲基化的胞嘧啶還可以與甲基化CpG結合蛋白家族（MeCPs）特異性結合，而后在甲基化位點募集轉錄共抑制子（如組蛋白脫乙酰酶、甲基轉移酶等）形成緊密包裹的染色質結構，阻止轉錄因子和調控元件結合為轉錄復合物，同時組蛋白發生脫乙酰化或甲基化修飾導致染色質構象改變，這種DNA甲基化和組蛋白修飾共同作用方式是抑制基因轉錄的主要途徑。

3 抑癌基因甲基化異常與胃癌

在胃癌發生、進展過程中，基因啟動子區發生高甲基化可使其表達沉默，進而影響相關細胞生物學行為，如細胞周期、細胞凋亡、信號轉導等。

3.1 細胞周期相關基因甲基化

3.1.1 P16 該基因亦稱多腫瘤抑制1（multipletumor suppressor 1，MTS1），屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白基因家族，是一種位于人類染色體9p21上的多腫瘤抑制基因。該基因的功能產物p16蛋白通過cyclinD1-CDK4/CDK6-PRb-E2F環路發揮負反饋調節作用，其可以與細胞周期素依賴激酶CDK4和CDK6結合，通過抑制激酶活性來阻斷細胞由G1期向S期過渡，從而控制細胞增殖。若p16基因有突變、缺失或甲基化改變，其表達會發生異常，導致上述環路的無限循環，進而使組織細胞過度增殖而癌變。Goto等[10]使用定量甲基化特異性PCR（qMSP）對49名胃癌患者組織中p16基因甲基化狀態進行檢測時發現17例（34%）檢測到p16基因啟動子區域發生異常高甲基化，后將臨床病理數據與這些結果相關聯發現淋巴轉移（P=0.046）和腫瘤部位（P=0.010）存在顯著性差異。這些結果表明p16基因是胃癌相關的腫瘤抑制因子，在淋巴浸潤性胃癌中甲基化的發生更為常見。Ding等[11]對p16基因外顯子1和外顯子2的甲基化模式的研究過程中發現20例胃癌組織中分別有25%和45%的p16基因外顯子1和外顯子2發生甲基化改變，而正常組織未見甲基化異常，這同樣也證明了p16基因高甲基化在胃癌發生、進展中起到了重要作用。

3.1.2 PAX5 PAX5是配對盒基因（paired box gene）家族的一員，定位于染色體9p13，長度190kb。是由Barberis等[12]于1989年首次發現的一種存在于B細胞中的核反式轉錄因子，編碼B細胞特異性激活蛋白，參與器官發育和組織分化調控。PAX5在胃癌中作為一種抑癌基因發揮著對腫瘤增殖和遷移的抑制作用，也可因其啟動子發生甲基化異常使p53信號通路上調而導致表達“沉默”。Li等[13]通過免疫共沉淀法發現PAX5可在與p53作用過程中促進其表達，還可抑制原癌基因MET的表達，間接抑制轉移抑制因子1（MTSS1）和組織金屬蛋白酶1抑制劑（TIMP1），從而抑制胃癌細胞轉移。由此可知PAX5作為抑癌基因可因其啟動子發生甲基化而失活，進而促進胃癌發生和進展。他們還發現PAX5在沉默胃癌細胞中異位表達可以抑制集落形成和細胞活性、阻滯細胞周期、誘導細胞凋亡、抑制細胞遷移及侵襲和抑制裸鼠致瘤性。他們通過研究還證實在77%的原發性胃癌中檢測到PAX5的甲基化現象，PAX5啟動子有兩個或多個甲基化CpG位點的患者要比PAX5啟動子有一個或沒有甲基化位點患者的生存期短，由此可見該基因甲基化改變與胃癌患者生存狀況相關。

3.2 細胞凋亡相關基因甲基化

3.2.1 DAPK 死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK），分子量約為 160KD，位于9p34.1，其產物具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，且受鈣調蛋白調節。該凋亡相關蛋白激酶可通過多種途徑參與細胞凋亡，其激活狀態會從凋亡初期持續到細胞發生不可逆自毀為止，而此該蛋白表達缺失又與腫瘤形成、侵襲和轉移等生物學行為密切相關。許多研究也發現DAPK表達缺失常出現于多種腫瘤中，并能抑制c-myc基因的致癌性轉化，同時其表達水平與腫瘤轉移率呈負相關。Sugita等[14]對80名胃癌患者術后采用氟嘧啶化療治療，并對化療反應和預后進行了比較，發現DAPK發生甲基化的患者其有效率顯著低于無甲基化發生患者（21%vs 49%，P=0.012），且DAPK發生甲基化患者的無進展生存時間短于無甲基化發生患者（P=0.007）。故DAPK基因啟動子區域發生高甲基化可以使其表達沉默，導致其腫瘤抑制作用顯著減弱，出現患者預后不良。Jia等[15]在評估DAPK基因啟動子甲基化在胃癌中的作用時進行了一項Meta分析，結果發現在DAPK基因啟動子甲基化和胃癌之間存在著顯著相關性（OR=3.23，95%CI=1.70-6.14，P＜ 0.001），同時DAPK啟動子甲基化與腫瘤分期和淋巴結狀態相關（OR=0.69，95%CI=0.49-0.96，P=0.03和OR=1.50，95%CI=1.12-2.01，P=0.007）。由此可見DAPK基因啟動子甲基化在胃癌發生和進展中發揮了關鍵作用。

3.2.2 RNF180 環指蛋白180（the finger protein 180，RNF180）定位于染色體5q12.3，是一種膜結合E3泛素連接酶，屬于泛素-蛋白酶體系統中泛素連接酶家族，在蛋白質降解中具有重要作用，參與細胞凋亡、DNA修復、細胞周期調控等多個重要細胞生理過程。RNF180基因甲基化異常與腫瘤的發生、進展密切相關。Cheung等[16]在體外實驗中發現其核心啟動子區（-202/372）甲基化可致使其表達沉默，7株胃癌細胞系中有6株RNF180基因表達沉默，與癌旁正常組織相比RNF180在胃癌組織中表達明顯下調（P=0.001）。198例原發性胃癌中150例檢測到RNF180啟動子甲基化，20例腸上皮化生中檢測出11例，但23例正常胃組織中均未發現甲基化的發生，且56%的胃癌患者血漿中檢測到了甲基化的RNF180。由此可見基因表達缺失與啟動子甲基化有關。通過上調抗增殖調節劑MTSS1、CDKN2A和促凋亡介質TIMP3可以使RNF180重新表達，從而抑制細胞生長和誘導細胞凋亡。上述結果表明，RNF180是胃癌發生過程中的抑癌因子，可作為胃癌診斷的生物標志物，并且具有潛在臨床應用價值。Xie等[17]在判定RNF180啟動子甲基化CpG位點個數與患者預后的關系時，發現RNF180基因啟動子7個或7個以上甲基化CPG位點患者存活率較高（P=0.008），從而認定RNF180基因啟動子甲基化CPG位點計數可用于評估胃癌患者預后。

3.3 信號轉導相關基因甲基化

3.3.1 RUNX3 Runt相關轉錄因子3（Runt-related transcription factor 3，RUNX3）是 RUNX 家族成員之一，定位于染色體1p36.1，全長約67kb，作為腫瘤抑制基因參與人類多種腫瘤的發生和進展，且對胃粘膜上皮生長、T細胞分化和脊神經節發育等均具有重要調控作用。RUNX3蛋白在人體內廣泛表達，且作為轉化生長因子信號通路下游轉錄因子發揮作用。RUNX3基因表達可因啟動子區高甲基化、雜合性缺失及點突變等發生異常，影響到上述信號通路并最終導致腫瘤發生。Wang等[18]對76例胃癌和24例正常胃組織RUNX3基因啟動子區域8個CpG位點甲基化狀態進行定量分析，發現RUNX3基因啟動子甲基化水平顯著高于正常且總體甲基化水平與腫瘤侵襲和TNM分期密切相關，而-1415位點甲基化可導致胃癌患者預后不良。Chen等[19]在對選取的70例胃癌組織進行研究時發現Runx3基因表達與正常胃黏膜相比具有統計學差異（P＜0.05），同時也發現Runx3基因蛋白表達水平在胃癌中顯著低于鄰近正常組織。以上結果均表明DNA甲基化引起Runx3基因表達下調常與胃癌進展具有相關性，Runx3基因可作為胃癌獨立預后因素和潛在治療靶點。

3.3.2 DACT l β-環連蛋白抑制基因1（disheveled-binding antagonist of beta-catenin 1,DACT 1）又稱為 HDPR 1，定位于染色體 14q23.1區域，是DAPPER家族成員之一。因其編碼的蛋白Dapper 1可通過對 NF-κB[20]、Wnt[21-22]、TGF-β[23]等多種信號通路的影響而作用于腫瘤的發生和進展，故這些通路的異常激活與多種腫瘤密切相關，許多研究表明DACT l基因表達水平在胃癌[20]、膀胱癌[24]、乳腺癌[22]等多種惡性腫瘤組織中較正常對照組低，且患者預后普遍較差。同時其他研究也證實DACT l基因啟動子區甲基化增高與其表達下調具有相關性[25-26]。Deng等[27]在對459例胃癌患者DACT l基因啟動子CpG位點甲基化狀態進行分析時發現28.32%的患者中DACT l啟動子發生甲基化改變，并且提出DACT l啟動子甲基化CpG位點在4個及以上時胃癌患者生存質量較差（P=0.19）。同時他們還對CpG-515、CpG-435和CpG-430位點甲基化狀態進行了鑒定，為459例胃癌患者提供了詳細的生存判別（P=0.049，P=0.006，和P=0.037）。由此可見胃癌組織中DACT l基因CpG島出現高甲基化與DACT l啟動子區甲基化CPG位點數量和胃癌患者預后存在相關性。另外，Katoh等[28]通過研究發現人DACT l的mRNA在腫瘤組織中主要分布于胃印戒細胞腫瘤中，其次是生殖細胞腫瘤、軟骨肉瘤、甲狀旁腺腫瘤等。

4 原癌基因甲基化異常與胃癌

表觀遺傳學改變中整體基因組低甲基化是最早開始研究的類型，這種甲基化模式的改變可以促使惰性基因尤其是原癌基因活化并使其表達增高，還可以阻止染色體凝集并影響中期染色體配對和分離，導致染色體斷裂、易位和缺失，從而誘發腫瘤。這種低甲基化可能與染色質重塑異常、DNA甲基轉移酶表達量降低、組蛋白修飾缺失等原因有關。許多研究結果表明可經低甲基化誘導胃癌發生的原癌基因包括ras、c-myc等。

4.1 Ras 該基因廣泛存在于真核生物中，具有重要生理功能，是研究較多的一種原癌基因。人類腫瘤中的ras基因家族可分為3種功能基因型，分別為Harvey-ras（H-ras）、Kirsten-ras（K-ras）和 Neuroblastoma（N-ras）。它們各自位于不同染色體但卻具有相似結構，編碼產物均為21KD的p21蛋白。該蛋白位于細胞膜內側且具有較弱的GTP酶活性，可與GDP或GTP結合而分別處于失活和激活狀態，并可通過兩種結合形式的相互轉換來調節信息傳遞從而參與細胞生理功能調節。胃癌中活化的基因型以H-ras和K-ras為主，且活化頻率變化較大，在我國H-ras活化較為常見。Luo等[29]研究發現H-ras基因啟動子在胃癌和結腸癌細胞中均呈現低甲基化。MTT測定中，經S-腺苷蛋氨酸處理的癌細胞生長抑制效率顯著高于正常細胞，且這種差異具有統計學意義（P＜0.05）。在進行集落形成測定時發現這種抑制效果在癌細胞中較正常細胞明顯，且差異顯著（P＜0.05）。通過甲基化特異性PCR（MSP）對H-ras啟動子區域CpG島甲基化狀態測定時發現經S-腺苷蛋氨酸處理后該基因啟動子發生重新甲基化，而與之形成鮮明對比的是和正常細胞CpG島相對的高甲基化模式并沒有顯示出顯著變化。而在隨后的定量RT-PCR檢測中也發現由于低甲基化改變使癌基因的mRNA和蛋白質水平下調。這些結果表明S-腺苷蛋氨酸可以特異性誘導癌基因H-ras上的DNA甲基化使其表達下調，從而抑制腫瘤細胞生長。

4.2 c-myc 禽類髓細胞病毒MC-29的v-myc基因同源序列（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog,c-Myc）定位于人染色體8q24，經DNA序列分析發現該基因具有3個外顯子及2個內含子，外顯子中也只有第二和第三個具有編碼功能，且其編碼產物為含439個氨基酸的蛋白質，由于該蛋白分子量約為62KD且位于核內，因而被稱為p62核蛋白。該基因具有轉化細胞的能力，還可與DNA、染色體結合，通過表達產物對細胞生長、分化及惡性轉化發揮重要調節作用。在探討S-腺苷蛋氨酸（SAM）對人胃癌細胞抑制作用及其抗腫瘤機制中，Zhao等[30]通過 MTT法檢測了SAM對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，又分別用不同濃度的SAM處理胃癌細胞72 h后對其表達和甲基化水平進行了檢測，還通過皮下注射胃癌SGC-7901細胞在裸鼠中建立腫瘤異種移植物，再將這些小鼠按照SAM使用濃度不同和有無分為低濃度組[192 μmol/（kg·day）]、高濃度組[768 μmol/（kg·day）]和對照組[生理鹽水（NS）]，15 d后對腫瘤大小進行測量。研究發現SAM明顯抑制SGC-7901細胞生長，且隨著SAM濃度和處理時間延長，SAM作用逐漸增強。SGC-7901細胞中c-myc基因的mRNA表達顯著降低，SAM處理后，SGC-7901細胞中的c-myc基因部分或完全甲基化。低濃度組和高濃度組腫瘤體積顯著低于對照組（均P＜0.01）。低濃度組腫瘤生長抑制率為39.26%，高濃度組抑制率為56.36%。S-腺苷蛋氨酸處理后，c-myc蛋白和mRNA表達量顯著降低（均P＜0.01），c-myc基因的低甲基化水平均發生改變。由此可見，S-腺苷蛋氨酸可抑制人胃癌細胞在體內和體外的生長,其機制可能是S-腺苷蛋氨酸可改變c-myc基因的低甲基化，減少其表達，進而抑制腫瘤生長。

5 展望

鑒于胃癌在我國的高發病率和高死亡率，早期且準確的診斷以及據此選取最佳治療方法就顯得尤為重要。越來越多的研究表明腫瘤相關基因啟動子區甲基化異常在許多腫瘤發生、進展過程中為一早期頻發事件，相對于其他分子生物學分析技術，DNA甲基化測定因其靈敏度高可實現組織中少數細胞甲基化變化的測定。另外，基因組DNA穩定性高于mRNA和蛋白質，其甲基化模式并不會隨外界的影響而短期內發生改變，且能隨細胞分裂而穩定遺傳。某些基因甲基化狀態改變既能在胃癌活組織檢查中被發現，也可以在血漿、尿液、唾液等非侵入性體液中檢測出，這對胃癌患者早期診斷、病情監測和預后評估等方面都具有重要意義。

DNA甲基化作為動態可逆過程，為腫瘤的預防和治療提供了新思路，甲基轉移酶抑制劑的應用正是基于這一點，其可使甲基化的抑癌基因去甲基化而使之重新激活并發揮抑制腫瘤作用。5-氮-2′-脫氧胞苷（5-Aza-CdR）作為去甲基化治療腫瘤的代表性藥物，通過與甲基轉移酶抑制劑共價結合而抑制其活性從而阻止或改變DNA甲基化異常。雖然DNA甲基轉移酶可以有效降低甲基化的發生并能延長患者生命，但這類藥物由于缺乏基因和組織特異性而易導致全基因組的普遍低甲基化，若使用不當甚至還可以誘導促癌基因活化并加速細胞癌變。

隨著對DNA甲基化在胃癌中發生機制研究不斷深入和相關檢測技術的不斷進步與成熟，當前所面臨的一系列問題都將得到解決，屆時胃癌的診療必將翻開其新篇章。