聲動力治療在動脈粥樣硬化中的應用進展

謝茜，趙云，劉蓉

動脈粥樣硬化是一種因脂質代謝和免疫應答障礙引起的慢性炎癥性血管疾病。動脈粥樣硬化斑塊的積累使動脈管腔狹窄、閉塞，從而導致缺血性血管疾病，如冠心病、周圍血管疾病、腦動脈疾病等［1］。目前，針對動脈粥樣硬化的治療方式主要有控制飲食、適當的運動、戒煙限酒等綜合治療；降脂、抗血小板聚集、擴張血管、溶栓、抗凝等藥物治療；重建、搭橋等外科介入手術治療［2］。這些治療方法在臨床上均取得了一定的治療效果，但存在治療周期長，不良反應大，且具有侵入性的問題。研究顯示，他汀類降脂藥物可明顯改善冠心病患者的生存期，但其擴血管作用較小，且這種藥物最低需要幾個月才能達到動脈邊緣水平的斑塊逆轉；經皮冠狀動脈介入治療可迅速擴大管腔并進行血管重建，改善心肌缺血癥狀，但容易導致冠狀動脈痙攣、支架內血栓和再狹窄等并發癥［3］。新型治療方法——聲動力治療（sonodynamic therapy，SDT）可抑制動脈粥樣硬化斑塊的進展，具有安全、局部治療對正常的組織影響較小、組織穿透能力強且能量無明顯衰減等優點。本研究就SDT對動脈粥樣硬化的作用及其機制進行綜述。

1 聲動力治療與聲敏劑

SDT是一種依靠低強度超聲和聲敏劑協同作用產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的新型無創治療方法。聲敏劑可優先特異性聚集在病變組織，聚焦超聲可激活聲敏劑在局部產生ROS，從而進行氧化損傷，達到較高的治療效果。SDT是在光動力療法的基礎上由日本學者Yumita等［4］提出的一種新的非侵入性的疾病治療方法。SDT與光動力療法的最大不同是超聲波可穿透人體深部組織，對需要治療的特定病理部位的作用更集中［5］。SDT最初運用于實體腫瘤，早在1989年Yumita等［4］就發現聲敏劑血卟啉介導的超聲治療提高了超聲對小鼠肉瘤180和腹水肝癌130細胞的敏感性，殺傷了更多的腫瘤細胞，由此提出了聲動力治療。Arakawa等［6］研究顯示，SDT在兔髂動脈支架模型中有抑制內膜增生的作用。目前，SDT已被證實可引起細胞凋亡和自噬，具有改善脂質沉積、減少炎性細胞浸潤、促進血管平滑肌細胞再增殖、防止基質降解等作用。

聲敏劑按其生物學功能和化學結構主要分成五大類：卟啉類化合物、黃原酮類化合物、抗腫瘤藥物、非甾體類抗炎藥和其他類型（二氫卟吩、新型納米分子和亞甲藍等）的聲敏劑。大多數聲敏劑已被研究用于現代腫瘤的治療，然而評估其在動脈粥樣硬化的潛在效果研究主要集中在原卟啉IX（protoporphyrin IX,PpIX）和5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA），這兩種聲敏劑可以選擇性地聚集在動脈斑塊中，斑塊中的濃度大約是正常血管壁的10～12倍，在體內和體外實驗均被證實具有良好的腫瘤治療效果［7］。值得注意的是，近幾年從中草藥提取物中發現的某些化合物如羥色胺黃A（ hydroxysafflor yellow A、HSYA）、金 絲 桃 素（hypericin,HY）也具有強大的聲動力學活性，且治療過程中少見由聲敏劑所引起的光敏性皮炎［8］。

2 細胞凋亡與細胞自噬

細胞凋亡的過程主要有外源性和內源性兩種通路：（1）外源性的死亡受體通路。死亡受體包括腫瘤壞死因子受體和神經生長因子超家族，主要有Fas、Apo-1、TRAM受體等。以Fas受體為例，當Fas受體與Fas配體結合后，導致Fas受體胞質區域內死亡結構域結合Fas結合蛋白（Fas-associated with death domain protein,FADD），FADD再以其氨基端的死亡效應結構域結合半胱天冬酶-8（cystein aspartic acid specific protease，caspase-8）前體，形成由 Fas-FADD-caspase-8前體組成的死亡片段復合物，激活caspase-8，活化的caspase-8再進一步激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等后續一系列反應，導致細胞凋亡［10］。（2）內源性的線粒體通路。線粒體是有核細胞能量產生與代謝的主要部位，而高能磷酸化合物可作為一種信號調節細胞凋亡，促進細胞有效吞噬。許多凋亡基因（如bcl-2家族）都位于線粒體膜上，凋亡基因與線粒體膜結合導致線粒體釋放細胞色素 C（cytochrome C，cytC），cytC 進入胞漿，與caspase-9的前體結合，激活caspase-9，活化的caspase-9進一步引起后續級聯反應，導致細胞凋亡［11］。

2.2細胞自噬 細胞自噬通常被認為是機體一種重要的防御和保護機制，細胞降解非必需的、衰老的或者無功能的蛋白質或細胞中細胞質和細胞器，并回收這些降解的成分以維持正常的細胞內環境平衡。最近研究表明，自噬在調節動脈粥樣硬化形成和增強動脈粥樣硬化斑塊穩定性方面發揮著關鍵作用［12］。自噬可以選擇性地清除動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞，降解脂質，在晚期動脈粥樣硬化中，巨噬細胞自噬可以減少炎癥反應［13］。

細胞自噬的形成過程為細胞胞漿形成雙層膜的囊泡，囊泡包裹細胞質或細胞器形成自噬體，自噬體逐漸變成單層膜后與溶酶體結合形成自噬溶酶體，然后溶酶體中多種不同的酶降解細胞質或者細胞器形成氨基酸和核苷酸，為細胞的生命活動提供能量。目前，雙層膜的囊泡來源并不清楚，有可能來自于粗面內質網、高爾基體，也有可能是細胞自身合成。其中許多ATG相關基因參與自噬的調節，Atg復合蛋白和微管相關蛋白質輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）泛素化有著重要的地位，Atg復合蛋白與外膜結合，可促進自噬體形狀的改變，同時微管相關蛋白質1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3-Ⅰ）蛋白被泛素化形成微管相關蛋白質2輕鏈3（microtubule-associated protein 2 light chain 3，LC3-Ⅱ），定位于膜上，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可以用來衡量自噬水平的高低［14］。

3 聲動力治療與細胞凋亡和細胞自噬

聲動力治療的基本機制理念有空化效應、自由基理論、ROS生成、細胞凋亡及細胞自噬。超聲激活聲敏劑產生ROS，是SDT發揮作用的主要機制之一。ROS不僅在腫瘤治療中發揮重要作用，在動脈粥樣硬化治療中也至關重要，目前，SDT在組織或細胞中產生ROS有2種可能的假說。第一種是聲致發光假說，超聲波在水性環境中產生稱為空化的現象，空化產生充滿氣體的氣泡，氣泡在一定程度上爆裂?？栈鶕晽l件和組織或細胞狀態可分為兩種類型：穩定空化和慣性空化，前者產生溫和的氣泡，其中大多數處于連續振動和振蕩狀態。后者與ROS生成關系更密切，產生的氣泡劇烈震蕩吸收更多的聲能，導致氣泡劇烈坍塌，在較小范圍內產生極端的物理條件，隨后發生一系列化學反應。在此過程中，氣泡積累了大量的能量，這些能量經歷物理聲致光現象以發光，產生的光可以激活聲敏劑，在微觀水平上誘發聲敏劑分子的電子軌道激發，一旦被激發的電子回到基態，釋放的電離輻射就可以在靶組織中產生ROS［15］。另一種假說是熱解假說，該假說認為當氣泡通過慣性空化劇烈坍縮時，局部溫度迅速上升至大約9 727℃，導致聲敏劑分解產生自由基，自由基與內源性物質進一步反應生成ROS。體內多種抗氧化酶和低分子量抗氧化劑在正常生理條件下清除細胞內過多的ROS，然而，SDT導致ROS濃度較高，不能迅速清除并保留在細胞中，從而使ROS在隨后引發多種效應［16］。

Li等［17］通過研究大鼠細胞凋亡與ROS的關系，證實了ROS通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，且ROS在細胞凋亡中起決定性作用。Yumita等［18］通過多羥基富勒烯研究SDT誘導的細胞凋亡，在SDT處理的細胞中可見DNA片段化和caspase-3活化，證實了SDT產生了細胞凋亡；同時使用活性氧清除劑組氨酸后，顯著抑制了caspase-3活化，從而抑制了SDT誘導的細胞凋亡。楊力明等［19］在羥基乙?；S素介導的SDT中證實，SDT通過細胞凋亡穩定了動脈粥樣硬化斑塊，且5 mg/L是該聲敏劑最佳的治療濃度。Zhuang等［20］通過甘氨酸脫羧酶誘導肝癌細胞自噬的實驗證實，ROS通過激活細胞外調節激酶和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途徑誘導非經典自噬，且氧化還原依賴的自噬在很大程度上依賴于ROS生成的大小和速率。Han等［12］證實，二氫卟吩介導的SDT通過產生ROS激活自噬，并可抑制巨噬細胞促炎因子的表達。

4 聲動力治療對動脈粥樣硬化的作用

4.1SDT介導細胞凋亡在動脈粥樣硬化中的作用 動脈粥樣硬化由動脈壁中的修飾脂蛋白如氧化的低密度脂蛋白的積累引發。在動脈粥樣硬化早期，單核細胞被招募到動脈壁內膜，以應對脂蛋白所造成的損傷，并分化成巨噬細胞，巨噬細胞通過清道夫受體攝取脂蛋白并轉化為泡沫細胞，幫助脂蛋白停留在動脈壁上。在動脈粥樣硬化的發展過程中，泡沫細胞內脂質不斷積累，導致慢性內質網應激，使泡沫細胞壞死，同時巨噬細胞分泌促炎因子，引起炎癥反應［21］。由于晚期粥樣硬化斑塊的吞噬功能缺陷，壞死的泡沫細胞不能有效地通過胞吐作用被清除，泡沫細胞內膽固醇被釋放在斑塊中，從而進一步導致炎癥反應的發生［22］。Wang等［23］通過用5-ALA介導的SDT處理西藥喂養的apoE-/-小鼠，分別于治療后第1、3、7、28天處死小鼠，結果表明5-ALA介導的SDT可導致泡沫細胞通過線粒體途徑凋亡，顯著降低晚期斑塊的內質網應激，減輕了炎癥反應，且第28天處死的小鼠的炎癥反應最輕，表明5-ALA介導的SDT具有一定的時間依賴性；另外，斑塊中Mer酪氨酸激酶（Mer酪氨酸激酶對凋亡細胞的吞噬和有效清除至關重要）陽性的巨噬細胞顯著增多，表明5-ALA介導的SDT提高了巨噬細胞的吞噬能力。Sun等［24］在動脈硬化晚期的兔和載脂蛋白缺乏的小鼠模型中發現，5-ALA介導的SDT誘導了細胞凋亡，且多數凋亡細胞表達出巨噬細胞標記物CD68（一種細胞漿糖蛋白），表明SDT在體內誘導了有缺陷的巨噬細胞凋亡，并在治療后的第3天可見斑塊中出現更多有胞吐功能的單核細胞，作用是清除凋亡的巨噬細胞，同時可見促炎因子的減少及抗炎因子的增加，表明SDT改善了動脈粥樣硬化斑塊的炎癥環境?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）主要由巨噬細胞產生，可降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM），導致纖維帽變薄，進一步引起斑塊的破裂和血栓的形成，在動脈粥樣硬化斑塊失穩的進展中發揮關鍵作用，同時MMPs可裂解凋亡受體，抑制細胞凋亡。因此，MMPs可能是治療動脈粥樣硬化血栓形成和預防急性心血管事件的治療靶點［25］。Li等［26］在兔的動脈粥樣斑塊模型中，通過5-ALA介導的SDT有效誘導動脈粥樣硬化巨噬細胞的凋亡，抑制了MMPs的產生，穩定了粥樣斑塊；且觀察到超聲強度1.5 W/cm2、頻率1.0 MHz，持續時間15 min、5-ALA的濃度為60 mg/kg時，5-ALA介導的SDT對粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的清除能力最強。

4.2SDT介導細胞自噬在動脈粥樣硬化中的作用 動脈粥樣硬化斑塊中容易破壞的斑塊稱為易損斑，易損斑的特點是有大量脂質核心，薄纖維帽、血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）和膠原蛋白較少，巨噬細胞密度高，ECM合成和降解不平衡。VSMCs在正常血管中表現出分化表型，在斑塊形成過程中，它們攝取脂質轉化為去分化表型，最終轉化為病灶內的泡沫細胞。VSMCs誘導的自噬可以阻止氧化的低密度脂蛋白觸發VSMCs來源的泡沫細胞形成，使VSMCs表現出分化表型；反之，缺乏VSMCs自噬可以改變鈣離子平衡而影響血管的收縮能力，因此，VSMCs的分化和自噬在動脈粥樣硬化的發生、發展過程中發揮重要作用，可能是動脈粥樣硬化的治療靶點。Li等［27］通過評價PpIX介導的SDT對VSMCs的活力和自噬的影響觀察到，SDT沒有引起VSMCs細胞凋亡；同時，SDT增加了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，并顯著增加了自噬體形成；PpIX-SDT可增加VSMCs的自噬，但不誘導線粒體依賴性細胞凋亡，穩定了粥樣斑塊。在正常情況下，氧化的低密度脂蛋白在巨噬細胞中可以自發觸發自噬，調節脂質代謝，然而，低水平的自噬很難逆轉巨噬細胞內的脂質積累，且脂質可導致溶酶體功能障礙，進而導致自噬缺陷［28］。另有研究顯示，SDT可誘導巨噬細胞自噬活性達到有效水平，通過自噬調節細胞內脂質代謝來阻止斑塊進展［29］。

HSYA是紅花植物親水性成分的主要組成部分，是一種靜脈注射治療心血管疾病的中藥，水溶性好，安全性高。Jiang等［30］認為HSYA可以作為聲敏劑，聯合超聲通過促進ROS生成，誘導人急性單核細胞白血病細胞株（THP-1）巨噬細胞自噬，同時上調ATP結合轉運體蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1；一種膽固醇流出調節蛋白）表達，促進巨噬細胞和巨噬細胞源性泡沫細胞的膽固醇外溢，抑制炎癥反應。Li等［31］通過研究中藥提取物金絲桃素（hypericin，HY）在THP-1巨噬細胞中誘導自噬的潛在機制顯示，HY介導的SDT通過調節ROS依賴的細胞轉錄調控因子EB（trancription factor EB，TFEB；一種自噬激活劑）核易位，誘導巨噬細胞自噬和溶酶體再生，促進脂質的降解，且TFEB的易位在SDT的2 h達到最強。因此，有些中藥提取物介導的SDT可誘導ROS產生自噬和溶酶體再生，有效降低脂質含量，抑制炎癥反應的發生。

5 問題與展望

SDT作為一種新的治療技術，已被證實具有改善脂質沉積、減少炎性細胞浸潤、促進血管平滑肌細胞分化、防止基質降解等作用，這些作用共同發揮抗動脈粥樣硬化的作用。然而，SDT在動脈粥樣硬化斑塊中的作用是復雜的，對實驗員的操作要求高，同時聲敏劑種類和濃度、超聲參數（頻率、強度和持續時間等）及治療時間等有待進一步研究，但目前SDT多處于臨床試驗階段，相信在不久的將來，聲動力治療將用于臨床，有望成為一種新的治療方法。