外泌體與膽道閉鎖肝纖維化研究進展

趙金鳳，詹江華

膽道閉鎖（Biliary atresia，BA）是一種威脅嬰幼兒生命的纖維性炎癥性疾病。北美及西歐的發(fā)病率約為1/16 000，東南亞發(fā)病率較高，約為1/9 600～1/5 300［1］。BA以肝內(nèi)膽管大量增生，膽道的炎性和纖維化性閉塞為病理特點，即使早期行肝門-空腸吻合術也只能改善膽汁引流，自體肝生存狀況欠佳，大多數(shù)的患兒仍會發(fā)生進行性肝纖維化,危及生命［2］。本文將從細胞因子、信號通路等方面分析外泌體與BA肝纖維化之間的關系，以期為臨床干預纖維化進程，延長BA患兒自體肝生存時間提供新的方向。

1 BA肝纖維化

肝纖維化是門靜脈周圍區(qū)域或?qū)嵸|(zhì)細胞外基質(zhì)沉積過多，導致肝結(jié)構扭曲、功能受損、可進展為肝硬化，最終可危及生命。BA的肝纖維化機制更為復雜，而且BA患兒發(fā)生不可逆的肝臟纖維化是阻礙自體肝生存的關鍵。因此，許多學者不遺余力地對BA肝纖維化機制進行探索，以期望發(fā)現(xiàn)有效遏制纖維化進程的靶點。目前，研究發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控因子及信號通路在肝纖維化中發(fā)揮至關重要的作用。其中，纖維結(jié)締組織生長因子（vonnective tissue growth factor，CTGF/CCN2）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是典型的促進肝纖維化進程的關鍵因子，在膽道上皮細胞和肝細胞上均有表達，而且兩者的早期表達均隨著肝纖維化程度的加深而愈加明顯［3］。此外，肝星狀細胞（HSCs）的活化被認為是肝纖維化的核心，而CTGF 能通過調(diào)節(jié)HSCs的活化以促進肝纖維化的發(fā)生［4］。TGF-β1同樣作為纖維化發(fā)生過程中關鍵的細胞因子，既能促進活化的HSCs遷移，又能介導HSCs轉(zhuǎn)分化，導致遷移至門管區(qū)的HSCs釋放大量基質(zhì)成分,加之轉(zhuǎn)分化而來的肌成纖維細胞也分泌大量細胞外基質(zhì)蛋白，最終使肝纖維化進一步加重［5-6］。BA患兒肝內(nèi)膽管上皮細胞會產(chǎn)生TGF-β2，當膽管損傷，整合素蛋白avβ6 啟動TGF-β1 信號通路，使之與磷酸化的Smad2/3形成絡合物，向細胞核移動，誘導細胞外基質(zhì)相關基因轉(zhuǎn)錄，分泌膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和纖維黏連蛋白，加重細胞外基質(zhì)沉積。信號通路下游分子基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）和人纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）過度表達，抑制了基質(zhì)成分降解，加速肝纖維化進程［7］。

2 外泌體

外泌體是多泡體與質(zhì)膜融合后釋放到細胞外環(huán)境中，并含有特殊的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 以及microRNA（miRNA）的納米級囊泡，具有一定生理功能［8-9］。體外培養(yǎng)后形成具有胞外酶活性的細胞系脫落的微囊泡，電鏡下測量其直徑約為50～100 nm。直至1987年，Johnstone 等［9］將其觀察到的網(wǎng)織紅細胞分泌的微小囊泡定義為外泌體（exosome）。細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細胞釋放的囊泡的統(tǒng)稱。外泌體是EVs中體積最小的囊泡［10］。其形成過程較為復雜，主要包含3 部分：（1）細胞外物質(zhì)或細胞膜蛋白由網(wǎng)格蛋白介導內(nèi)吞后形成胞內(nèi)早期內(nèi)體。（2）在細胞內(nèi)逐漸成熟，形成晚期內(nèi)體，在內(nèi)體分選復合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）的協(xié)調(diào)下以內(nèi)出芽方式組裝成腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），此時的晚期內(nèi)體稱為多泡體（multivesicular bodies，MVBs）。（3）一部分MVBs直接與溶酶體結(jié)合，被降解后排出；另一部分MVBs 與質(zhì)膜融合時ILVs 被釋放到細胞外，即外泌體。超速離心提取時其在1.13～1.19 g/mL蔗糖密度范圍富集。在體內(nèi)廣泛分布于包括血液、唾液、尿液、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液、膽汁、羊水、惡性腹水等在內(nèi)的體液中，其在血清中濃度約3×106/μL［10-11］。

外泌體不僅在體內(nèi)分布廣泛，且依靠其自身特性具有一定的功能：（1）含有大量參與細胞信號通路的蛋白，如β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、WNT5B、Notch配體Delta-like 4（Dll4）。（2）功能性傳遞。體外實驗證明外泌體同時包含mRNA和microRNA，可以被傳遞到另一個細胞，并在新的位置發(fā)生或影響轉(zhuǎn)錄和翻譯［12］。（3）細胞間通信。由某種分泌外泌體的細胞（近端元素）、包裹了信號分子的外泌體（信使）及接收和處理信息的遠端細胞3部分構成［13］。（4）免疫調(diào)節(jié)，B 淋巴細胞釋放含有主要組織相容性復合體（MHC）Ⅱ的外泌體，能引起T 細胞反應。外泌體在腫瘤檢測及組織修復方面應用前景廣泛［14-16］。

3 外泌體參與BA肝纖維化的調(diào)節(jié)

近年來，隨著對外泌體的研究升溫，其參與調(diào)節(jié)BA 肝纖維化的功能也逐漸被關注。外泌體主要是作為細胞間信號傳遞的載體來調(diào)節(jié)肝纖維化進程。已知CTGF/CCN2促進肝纖維化發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在BA肝纖維化患兒體內(nèi)，CCN2在肝細胞、膽管上皮細胞表達量也與肝纖維化程度呈正相關［3］。CCN2 的含量受轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Twist1、miRNA-214 影響。在肝實質(zhì)細胞內(nèi)，Twist1 驅(qū)動miRNA-214 與CCN2 的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）靶向結(jié)合，直接導致CCN2的mRNA 表達量下降［4］。一般情況下，靜止的HSCs分泌包含miRNA-214 的外泌體，并向臨近細胞傳遞，在靶細胞內(nèi)與CCN2 的3′-UTR 結(jié)合，所以，CCN2的含量保持在正常水平，不會過度升高［17］。當肝臟組織受損誘發(fā)肝臟纖維化時，HSCs 發(fā)生活化，活化后的HSCs 可分泌包含CCN2 或CCN2 mRNA 的外泌體，通過質(zhì)膜融合，CCN2 或CCN2 mRNA 向臨近靜止或活化的HSCs 轉(zhuǎn)移，隨后靶細胞中CCN2 的濃度升高，α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和膠原的表達也隨之增加，肝纖維化程度加重［18］。可見外泌體能通過Twist1-miRNA-214-CCN2 軸或直接傳遞CCN2 影響肝纖維化進程。外泌體作為一種特殊的細胞間通訊載體，能將包含特定的功能性物質(zhì)通過運輸、質(zhì)膜融合向臨近細胞轉(zhuǎn)移來參與肝纖維化。

目前，BA 的病毒感染學說較為普遍，也是目前研究最多的發(fā)病原因之一。除此之外，炎癥和免疫調(diào)控失調(diào)學說也備受關注。多種細胞因子均參與BA 及其肝纖維化過程。輔助性T 細胞（Treg）和Th17 細胞的發(fā)展受TGF-β1 的影響，Treg/Th17 比值越高，BA 肝纖維化程度越重［19］。TGF-β1 是肝纖維化發(fā)生過程中關鍵的細胞因子，Smad 蛋白家族是TGF-β超家族重要的細胞因子，TGF-β1/Smad2/3通路也是促進BA 肝纖維化發(fā)生的重要通路之一。Th17 細胞參與自身免疫性疾病、炎癥反應疾病，其分泌的IL-17 誘導IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）、單核細胞趨化蛋白（MCP）-1、巨噬細胞炎性蛋白（MIP）-2 等促炎細胞因子的表達，導致肝組織和膽管組織損傷。隨著BA 肝纖維化的加重，Th17 細胞數(shù)量明顯增加，分泌的IL-17隨之增加，導致肝組織受損加重，加速纖維化進程。近來研究發(fā)現(xiàn)，損傷的肝細胞分泌的外泌體會激活HSCs 表面的Toll 樣受體3（TLR3），進而通過增強γσ T 細胞生成大量的IL-17而加劇肝纖維化［20］。說明，外泌體不僅能作為一種信號轉(zhuǎn)導載體，還能刺激炎癥細胞分泌細胞因子，間接影響肝纖維化。

外泌體作為一種包含特定物質(zhì)的納米級囊泡，具有一定的生理或病理功能。近來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與某些肝纖維化相關的信號通路。其中，Notch信號通路是一種由細胞接觸介導的進化保守通路，Dll4是Notch的配體之一。Zagory等［21］提出Notch信號通路與BA 病理改變相關，當HSCs 活化時，Notch信號通路就會被激活。人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）能產(chǎn)生含有Dll4 的外泌體，并通過質(zhì)膜融合使Dll4蛋白實現(xiàn)細胞間轉(zhuǎn)移，從而抑制Notch信號傳導。此外，Notch 通路與Hedgehog（Hh）通路二者相互作用調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal epithelial transition，MET），阻斷Notch通路會抑制Hh 通路并引起MET，阻斷Hh 通路同樣會抑制Notch 通路并引起MET。在發(fā)生肝硬化的動物模型中，肌成纖維細胞-肝星狀細胞（MF-HSC）和膽管細胞釋放含有生物活性Hh配體的外泌體，尤其在膽管結(jié)扎的小鼠血漿和膽汁中，包含Hh配體的外泌體數(shù)量明顯增加［22］。這或許對我們臨床阻止EMT緩解肝纖維化提供了新的思路。

外泌體不僅能通過細胞間通訊改變靶細胞的表達，而且能夠影響受體細胞的活動。如：外泌體能調(diào)節(jié)HSCs的遷移［20］。肝纖維化的中心環(huán)節(jié)即為HSCs的活化，只有活化后的HSCs 才能遷移至門管區(qū)，并釋放大量基質(zhì)成分或者轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞分泌膠原蛋白，使更多HSCs活化，促進肝纖維化進程［5］。研究發(fā)現(xiàn)外泌體能夠參與這一重要過程：當其參與調(diào)節(jié)HSCs 遷移時，首先表面的纖維粘連蛋白（FN）誘導黏附HSCs，并經(jīng)過內(nèi)吞進入細胞內(nèi)，然后外泌體內(nèi)部包含的脂酶鞘胺醇激酶1（SK1）及其產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸（S1P）發(fā)揮作用，趨化活化的HSCs 信號轉(zhuǎn)導與遷移［23］。那么，若能夠阻止這些有助于HSCs遷移的外泌體生成，也就能降低門管區(qū)的基質(zhì)大量沉積及更多的HSCs發(fā)生活化，也許就能有效地緩解肝纖維化進程。

4 外泌體抑制BA肝纖維化

某些干細胞來源的外泌體會通過抑制肝纖維化相關的細胞因子來抵抗肝纖維化。脂肪組織來源間充質(zhì)干細胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）分泌的外泌體通過抑制TGF-β1緩解肝纖維化［24］。TGF-β1 是BA 患兒發(fā)生不可逆性肝纖維化的關鍵細胞因子。肝臟Kuffer細胞產(chǎn)生TGF-β1，誘導HSCs 活化，活化的HSCs 同樣產(chǎn)生TGF-β1 并且上調(diào)其受體，形成自體循環(huán)，刺激纖維細胞大量增殖，加速肝纖維化進程。TGF-β1啟動子區(qū)域有2 個Stat3 結(jié)合位點，在HSCs 中Stat3 的激活啟動了TGF-β1促纖維化，Stat3也被發(fā)現(xiàn)介導Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，TGF-β1通過MAPK/ERK通路增加Bcl-2的表達［25］。而ADSCs 來源的外泌體通過與臨近靶細胞質(zhì)膜融合，發(fā)生信號傳遞，使HSCs中Stat3和Bcl-2的表達下調(diào)，并激活細胞自噬，抑制TGF-β1誘導的細胞纖維化基因表達，顯著下調(diào)肝臟Ⅰ型膠原、波形蛋白、α-SMA和纖維粘連蛋白，那么TGF-β1信號通路下游的TIMP-1和PAI-1表達也會受抑制，最終使細胞外基質(zhì)沉積明顯受抑，阻止肝臟纖維化進程［24］。由此可見，未來干細胞來源的外泌體干擾纖維化進程很有前景，無論是抑制相關的細胞因子活性，還是誘導關鍵的細胞自噬，均有待進一步的研究探索。

外泌體能夠通過干擾BA 肝纖維化發(fā)生的重要信號通路來抵抗肝纖維化。如：人臍帶間充質(zhì)干細胞（HUMSC）來源的外泌體能通過滅活TGF-β1/Smad2/3 信號通路，抑制肝纖維化進程［26］。肝纖維化初始階段，TGF-β1/Smad2/3信號通路是導致細胞外基質(zhì)成分增加促進肝纖維化的重要通路之一。BA 患兒肝內(nèi)膽管上皮細胞表達TGF-β1 增加，Smad2蛋白在胞質(zhì)與胞核之間“磷酸化與非磷酸化”轉(zhuǎn)換效率升高，在胞質(zhì)與胞核之間穿梭傳遞促纖維化信號速度加快。經(jīng)膽管損傷等因素刺激后，TGFβ1 會與磷酸化的Smad2/3 形成絡合物，在細胞核內(nèi)啟動細胞外基質(zhì)蛋白等相關基因轉(zhuǎn)錄、促纖維化基因轉(zhuǎn)錄速度加快，最終促進細胞外基質(zhì)蛋白生成，激活HSCs、活化肌成纖維細胞，從而促進肝纖維化進程［27］。實驗發(fā)現(xiàn)HUMSC來源的外泌體能抑制TGFβ1、Smad2 的磷酸化及TGF-β1 誘導的EMT，導致經(jīng)四氯化碳（CCl4）誘導的纖維化肝臟質(zhì)地變軟，顯著恢復血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積［26］。需要注意的是，BA 肝纖維化機制較為復雜，TGF-β1/Smad2/3信號通路僅在早期纖維化進程中作用明顯，隨著肝纖維化程度進一步加重至肝硬化時期，該信號通路作用減弱。所以，干細胞來源的外泌體若進一步發(fā)展用于臨床阻止纖維化進程時，應用時機的選擇也是至關重要的。

5 小結(jié)與展望

外泌體作為一種納米級的囊泡，內(nèi)部卻包含了豐富的分子信息，外吐小體（Exocarta）數(shù)據(jù)庫最新數(shù)據(jù)顯示，目前已確定的有9 769 種蛋白質(zhì)、3 408 種mRNA 和2 838 種miRNAs，它們是其發(fā)揮新型細胞間通訊功能的重要承擔者。哺乳動物幾乎所有體細胞均能分泌外泌體，包括HSCs、肝細胞、膽管上皮細胞等［28］。研究發(fā)現(xiàn)外泌體直接或間接地影響B(tài)A肝纖維化進程，起到促進或抑制作用，對未來遏制肝纖維化進程延長BA 患兒自體肝生存時間提供一個新的方向。綜上所述，外泌體通過傳遞特定的細胞因子、配體或miRNAs；參與肝纖維化相關的信號通路；調(diào)節(jié)HSCs的遷移等來調(diào)節(jié)BA肝纖維化。相信隨著研究的不斷深入，外泌體也許能夠在BA肝纖維化發(fā)生、發(fā)展方面有新的突破。尤其值得注意的是，干細胞來源的外泌體更是具有治療前景，若能據(jù)此找出遏制肝纖維化進程的有效手段，就能成功延長BA患兒自體肝生存時間。