SIRT1、SIRT2和IL-37在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織的表達(dá)

張紅霞，任春娥，王曉靜，張勇，王桂麗△

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）是常見的婦科疾病，是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮體以外的部位，多見于生育期女性，可以引起患者下腹痛和痛經(jīng)、性交不適、月經(jīng)異常及不孕等。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展是機(jī)體內(nèi)外環(huán)境因素作用下一個(gè)復(fù)雜、多因素、多步驟的病理生理過程。目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，近年來免疫炎癥因素成為子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。SIRT1、SIRT2是沉默信息調(diào)節(jié)蛋白（Sirtuins）家族中重要的成員，Sirtuins 是一類依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的蛋白去乙酰化酶，在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、DNA 修復(fù)、代謝、凋亡、增殖等生理活動(dòng)中發(fā)揮著十分重要的調(diào)節(jié)作用［1］。IL-37可直接抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，具有抗炎作用［2］。本文通過觀察SIRT1、SIRT2 及IL-37 在正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)差異，旨在探討子宮內(nèi)膜異位癥患者可能的發(fā)病機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2016年12月—2017年12月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科30例正常子宮內(nèi)膜組織及30例子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜組織。正常子宮內(nèi)膜組織在宮腔鏡檢查或子宮手術(shù)時(shí)獲取，異位內(nèi)膜組織為行卵巢巧克力囊腫剝除術(shù)時(shí)獲取。所有患者的內(nèi)膜組織均經(jīng)病理檢查確診。年齡25～40歲。患者月經(jīng)周期規(guī)律，無其他合并癥及并發(fā)癥，無婦科內(nèi)分泌疾病、生殖道炎癥，宮腔內(nèi)未放置宮內(nèi)節(jié)育器，非妊娠期或哺乳期。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人SIRT1（bs-0921R）、SIRT2（bs-7350R）、IL-37（bs-8811R）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，SP法免疫組化試劑盒、DAB底物顯色劑、EDTA抗原修復(fù)液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 檢測方法 免疫組化法檢測SIRT1、SIRT2和IL-37表達(dá)。取非內(nèi)異癥患者正常子宮內(nèi)膜組織及異位癥患者異位內(nèi)膜組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后放入4%甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)脫水和石蠟包埋。切片、烤片，然后用二甲苯脫蠟2遍，梯度乙醇水化，然后用3%H2O2室溫浸泡20 min 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再進(jìn)行抗原修復(fù)，分別滴加稀釋的一抗（1∶200），37 ℃孵育2 h 后，滴加二抗，37 ℃孵育30 min。DAB 顯色：使用DAB顯色試劑盒，1 mL蒸餾水加顯色劑一滴，混勻，加至標(biāo)本上，顯色3 min，自來水充分沖洗；蘇木素復(fù)染1 min，自來水沖洗返藍(lán)3 min，梯度乙醇脫水，再放入二甲苯中浸泡2遍，中性樹脂封片。光鏡下觀察組織形態(tài)，以已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。篩選組織標(biāo)本并將正常內(nèi)膜及異位內(nèi)膜按病理結(jié)果分為增殖期和分泌期。

1.2.3 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染為棕黃色為陽性細(xì)胞。每張切片在高倍鏡下（×200倍）隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)高倍視野均計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各視野中陽性細(xì)胞數(shù)的平均百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評分：≤1%計(jì)0 分，1%～10%計(jì)1 分，11%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，＞76%計(jì)4 分。根據(jù)染色強(qiáng)度評分，以多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特征為標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞未著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色或棕黃色計(jì)2分，棕黃色或棕褐色計(jì)3分。染色強(qiáng)度需與背景相對比，將兩者得分相乘，0～3分為陰性（－）表達(dá)，4～12分為陽性（+）表達(dá)［3］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常子宮內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織中SIRT1、SIRT2 及IL-37 蛋白的表達(dá) SIRT1、SIRT2 及IL-37主要分布在內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)中（圖1），正常子宮內(nèi)膜組織SIRT1、SIRT2、IL-37陽性表達(dá)率分別為90%、86.7%、86.7%，而在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜中SIRT1、SIRT2、IL-37 陽性表達(dá)率分別為33%、20%、36.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 不同月經(jīng)周期正常子宮內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織SIRT1、SIRT2 及IL-37 表達(dá)情況 將正常內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織根據(jù)形態(tài)分為增殖期與分泌期，其中正常內(nèi)膜組織增殖期12例、分泌期18例，異位內(nèi)膜組織增殖期16例、分泌期14例。正常內(nèi)膜和異位內(nèi)膜不同月經(jīng)周期SIRT1、SIRT2 及IL-37 陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。同一月經(jīng)周期異位內(nèi)膜組織SIRT1、SIRT2 及IL-37 蛋白表達(dá)陽性率均低于正常內(nèi)膜組織，見表3。

Tab.2 Expressions of SIRT1,SIRT2 and IL-37 in normal and ectopic endometrial tissues during proliferative and secretory phases表2 SIRT1、SIRT2及IL-37在正常內(nèi)膜組織及異位內(nèi)膜組織增殖期和分泌期的表達(dá) 例（%）

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥在形態(tài)學(xué)上呈良性表現(xiàn)，但在臨床行為學(xué)上具有類似惡性腫瘤的特點(diǎn)，如種植、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等，其發(fā)生包括黏附、侵襲和血管生成3 個(gè)環(huán)節(jié)。炎性反應(yīng)在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，可以減少細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)異位內(nèi)膜的黏附、侵襲及血管生成能力［4］。

Fig.1 Immunohistochemical staining of SIRT1,SIRT2 and IL-37 in different endometrial tissues(SP,×200)圖1 不同子宮內(nèi)膜組織中SIRT1、SIRT2和IL-37的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（SP，×200）

3.1 SIRT1、SIRT2與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系 本研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中SIRT1、SIRT2表達(dá)水平較正常子宮內(nèi)膜組織均顯著降低。關(guān)于SIRT2 在子宮內(nèi)膜中的作用，尚未有研究報(bào)道。Taguchi 等［5］研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以激活SIRT1，即使在腫瘤壞死因子（TNF）-α 刺激下，也能顯著抑制異位子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞IL-8 的釋放，而Sirtinol（SIRT1 抑制劑）對SIRT1 的抑制作用可促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞分泌IL-8，說明SIRT1 的激活在調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)中起著重要的作用，白藜蘆醇有可能通過內(nèi)源性SIRT1的激活來抑制炎癥反應(yīng)，與本研究中SIRT1 在異位子宮內(nèi)膜組織低表達(dá)結(jié)果相符。

Tab.3 Expressions of SIRT1,SIRT2 and IL-37 in normal endometrium and ectopic endometrium during proliferative and secretory phases表3 SIRT1、SIRT2及IL-37在正常子宮內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織增殖期及分泌期的表達(dá) 例（%）

3.2 IL-37與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系 Jiang等［6］研究表明，IL-37在正常在位子宮內(nèi)膜組織和異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中均有表達(dá)，而在子宮腺肌病患者在位子宮內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜中，IL-37的mRNA和蛋白表達(dá)水平較低，另外IL-1β、IL-18、TNF-α、干擾素（IFN）-γ 和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β 均能促進(jìn)IL-37的合成。另有研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清和腹腔液中IL-37水平明顯高于無子宮內(nèi)膜異位癥婦女，IL-37 mRNA 與NF-κB mRNA 表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清IL-37 水平升高可能會(huì)抑制NF-κB 的活化［7］。給予EMT 小鼠肌肉注射重組人IL-37（rhIL-37）后，發(fā)現(xiàn)rhIL-37可降低子宮內(nèi)膜異位癥樣病變的大小和質(zhì)量，降低IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、可溶性細(xì)胞間黏附分子-I（ICAM-I）的表達(dá)，推測IL-37 通過多種信號(hào)途徑抑制細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲，從而影響子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生和發(fā)展［2］。本研究中抗炎細(xì)胞因子IL-37在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中表達(dá)水平低于正常子宮內(nèi)膜組織，與上述結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究顯示SIRT1、SIRT2及IL-37在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中低表達(dá)，推測SITR1、SIRT2 激活及IL-37 可通過抑制炎癥反應(yīng)抑制異位子宮內(nèi)膜的侵襲和轉(zhuǎn)移。