SIRT1、SIRT2和IL-37在子宮內膜異位癥患者異位內膜組織的表達

張紅霞，任春娥，王曉靜，張勇，王桂麗△

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMT）是常見的婦科疾病，是指具有生長功能的子宮內膜組織（腺體和間質）出現在子宮體以外的部位，多見于生育期女性，可以引起患者下腹痛和痛經、性交不適、月經異常及不孕等。子宮內膜異位癥的發生發展是機體內外環境因素作用下一個復雜、多因素、多步驟的病理生理過程。目前子宮內膜異位癥的發病機制仍不清楚，近年來免疫炎癥因素成為子宮內膜異位癥發病機制的研究熱點。SIRT1、SIRT2是沉默信息調節蛋白（Sirtuins）家族中重要的成員，Sirtuins 是一類依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+的蛋白去乙酰化酶，在細胞的炎癥反應、DNA 修復、代謝、凋亡、增殖等生理活動中發揮著十分重要的調節作用［1］。IL-37可直接抑制促炎細胞因子的產生，具有抗炎作用［2］。本文通過觀察SIRT1、SIRT2 及IL-37 在正常子宮內膜組織及子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中的表達差異，旨在探討子宮內膜異位癥患者可能的發病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2016年12月—2017年12月濰坊醫學院附屬醫院婦科30例正常子宮內膜組織及30例子宮內膜異位癥患者的異位內膜組織。正常子宮內膜組織在宮腔鏡檢查或子宮手術時獲取，異位內膜組織為行卵巢巧克力囊腫剝除術時獲取。所有患者的內膜組織均經病理檢查確診。年齡25～40歲。患者月經周期規律，無其他合并癥及并發癥，無婦科內分泌疾病、生殖道炎癥，宮腔內未放置宮內節育器，非妊娠期或哺乳期。本研究經醫院倫理委員會批準，患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人SIRT1（bs-0921R）、SIRT2（bs-7350R）、IL-37（bs-8811R）均購自北京博奧森生物技術有限公司，SP法免疫組化試劑盒、DAB底物顯色劑、EDTA抗原修復液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 檢測方法 免疫組化法檢測SIRT1、SIRT2和IL-37表達。取非內異癥患者正常子宮內膜組織及異位癥患者異位內膜組織，經生理鹽水沖洗后放入4%甲醛溶液中固定24 h，常規脫水和石蠟包埋。切片、烤片，然后用二甲苯脫蠟2遍，梯度乙醇水化，然后用3%H2O2室溫浸泡20 min 阻斷內源性過氧化物酶，再進行抗原修復，分別滴加稀釋的一抗（1∶200），37 ℃孵育2 h 后，滴加二抗，37 ℃孵育30 min。DAB 顯色：使用DAB顯色試劑盒，1 mL蒸餾水加顯色劑一滴，混勻，加至標本上，顯色3 min，自來水充分沖洗；蘇木素復染1 min，自來水沖洗返藍3 min，梯度乙醇脫水，再放入二甲苯中浸泡2遍，中性樹脂封片。光鏡下觀察組織形態，以已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。篩選組織標本并將正常內膜及異位內膜按病理結果分為增殖期和分泌期。

1.2.3 陽性判斷標準 細胞質或細胞核染為棕黃色為陽性細胞。每張切片在高倍鏡下（×200倍）隨機選取3個視野，每個高倍視野均計數100個細胞，計算各視野中陽性細胞數的平均百分數進行評分：≤1%計0 分，1%～10%計1 分，11%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞76%計4 分。根據染色強度評分，以多數陽性細胞呈現的染色特征為標準：細胞未著色計0分，淡黃色計1分，黃色或棕黃色計2分，棕黃色或棕褐色計3分。染色強度需與背景相對比，將兩者得分相乘，0～3分為陰性（－）表達，4～12分為陽性（+）表達［3］。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0 對數據進行分析，計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常子宮內膜組織及異位內膜組織中SIRT1、SIRT2 及IL-37 蛋白的表達 SIRT1、SIRT2 及IL-37主要分布在內膜腺上皮細胞胞質中（圖1），正常子宮內膜組織SIRT1、SIRT2、IL-37陽性表達率分別為90%、86.7%、86.7%，而在子宮內膜異位癥患者異位內膜中SIRT1、SIRT2、IL-37 陽性表達率分別為33%、20%、36.7%，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 不同月經周期正常子宮內膜組織及異位內膜組織SIRT1、SIRT2 及IL-37 表達情況 將正常內膜組織及異位內膜組織根據形態分為增殖期與分泌期，其中正常內膜組織增殖期12例、分泌期18例，異位內膜組織增殖期16例、分泌期14例。正常內膜和異位內膜不同月經周期SIRT1、SIRT2 及IL-37 陽性表達率差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。同一月經周期異位內膜組織SIRT1、SIRT2 及IL-37 蛋白表達陽性率均低于正常內膜組織，見表3。

Tab.2 Expressions of SIRT1,SIRT2 and IL-37 in normal and ectopic endometrial tissues during proliferative and secretory phases表2 SIRT1、SIRT2及IL-37在正常內膜組織及異位內膜組織增殖期和分泌期的表達 例（%）

3 討論

子宮內膜異位癥在形態學上呈良性表現，但在臨床行為學上具有類似惡性腫瘤的特點，如種植、侵襲及遠處轉移等，其發生包括黏附、侵襲和血管生成3 個環節。炎性反應在子宮內膜異位癥的發生、發展中起著重要作用，可以減少細胞凋亡，增強異位內膜的黏附、侵襲及血管生成能力［4］。

Fig.1 Immunohistochemical staining of SIRT1,SIRT2 and IL-37 in different endometrial tissues(SP,×200)圖1 不同子宮內膜組織中SIRT1、SIRT2和IL-37的免疫組織化學染色結果（SP，×200）

3.1 SIRT1、SIRT2與子宮內膜異位癥的關系 本研究顯示，子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中SIRT1、SIRT2表達水平較正常子宮內膜組織均顯著降低。關于SIRT2 在子宮內膜中的作用，尚未有研究報道。Taguchi 等［5］研究發現白藜蘆醇可以激活SIRT1，即使在腫瘤壞死因子（TNF）-α 刺激下，也能顯著抑制異位子宮內膜組織細胞IL-8 的釋放，而Sirtinol（SIRT1 抑制劑）對SIRT1 的抑制作用可促進異位子宮內膜組織細胞分泌IL-8，說明SIRT1 的激活在調節炎癥細胞因子的表達中起著重要的作用，白藜蘆醇有可能通過內源性SIRT1的激活來抑制炎癥反應，與本研究中SIRT1 在異位子宮內膜組織低表達結果相符。

Tab.3 Expressions of SIRT1,SIRT2 and IL-37 in normal endometrium and ectopic endometrium during proliferative and secretory phases表3 SIRT1、SIRT2及IL-37在正常子宮內膜組織和異位內膜組織增殖期及分泌期的表達 例（%）

3.2 IL-37與子宮內膜異位癥的關系 Jiang等［6］研究表明，IL-37在正常在位子宮內膜組織和異位癥患者子宮內膜組織中均有表達，而在子宮腺肌病患者在位子宮內膜和異位子宮內膜中，IL-37的mRNA和蛋白表達水平較低，另外IL-1β、IL-18、TNF-α、干擾素（IFN）-γ 和轉化生長因子（TGF）-β 均能促進IL-37的合成。另有研究表明，子宮內膜異位癥患者血清和腹腔液中IL-37水平明顯高于無子宮內膜異位癥婦女，IL-37 mRNA 與NF-κB mRNA 表達呈顯著負相關，子宮內膜異位癥患者血清IL-37 水平升高可能會抑制NF-κB 的活化［7］。給予EMT 小鼠肌肉注射重組人IL-37（rhIL-37）后，發現rhIL-37可降低子宮內膜異位癥樣病變的大小和質量，降低IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、血管內皮生長因子（VEGF）、可溶性細胞間黏附分子-I（ICAM-I）的表達，推測IL-37 通過多種信號途徑抑制細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲，從而影響子宮內膜異位癥的發生和發展［2］。本研究中抗炎細胞因子IL-37在子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中表達水平低于正常子宮內膜組織，與上述結果相一致。

綜上所述，本研究顯示SIRT1、SIRT2及IL-37在子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中低表達，推測SITR1、SIRT2 激活及IL-37 可通過抑制炎癥反應抑制異位子宮內膜的侵襲和轉移。