米諾環素對脊髓損傷大鼠凋亡機制探索和神經紅蛋白表達的影響

陳萌，馬衛軍，馬泉，劉勝，王愛樂

脊髓損傷是一種致殘率高、預后較差的疾病，主要的病理改變是缺血、缺氧誘導的繼發性病理損傷。脊髓繼發性損傷的重要病理機制是神經細胞凋亡導致的神經元大量丟失，如何有效抑制這部分神經細胞的凋亡是治療脊髓損傷的關鍵［1-3］。米諾環素是四環素族藥物的衍生物，是一種安全有效的神經保護劑，具有分子質量小和易于透過血腦屏障的特點，長期口服無明顯的不良反應且安全有效［4］。2003年Wells等［5］首先將其應用于脊髓損傷的動物研究中，發現其可以顯著減少創傷后的組織壞死，保護脊髓白質和脊髓前角運動神經元。本課題組前期研究發現米諾環素可以提高脊髓損傷大鼠后肢運動功能評分［6-7］，但其主要作用機制和對細胞凋亡的影響尚不清楚。因此，本實驗將米諾環素預防性地應用于脊髓橫斷大鼠，旨在觀察其對脊髓橫斷大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3 和Ngb 蛋白表達及對神經細胞凋亡的影響，為進一步預防和治療脊髓損傷提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理 健康雄性Wistar 大鼠36 只，體質量200～250 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。大鼠隨機分為假手術組、脊髓損傷組、米諾環素干預組，每組12只。米諾環素預處理組大鼠術前腹腔注射米諾環素（90 mg/kg），1 次/d，連續5 d；脊髓損傷組和假手術組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。5 d后脊髓損傷組和米諾環素預處理組大鼠制備胸3～4節段交界處的脊髓全橫斷損傷模型。

1.2 藥物、試劑及儀器 米諾環素膠囊（惠氏制藥有限公司生產，100 mg/粒，批號：1001012），使用前溶于5 mL生理鹽水中，pH=5.7。一抗分別為兔抗Bcl-2 多克隆抗體（Gene Tex，美國）、兔抗Bax 單克隆抗體（AR Biosciences，美國）、兔抗Caspase-3多克隆抗體（Abcam，美國），濃縮型DAB顯色試劑盒和免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司）；鼠抗Ngb多克隆抗體（Santa Cruz，美國）；熒光二抗Alexa Fluor?594-羊抗鼠IgG（Invitrogen，美國）；Hoechst 33342（Sigma，美國）；倒置熒光顯微鏡、石蠟切片機（Leica，德國）。

1.3 動物模型制備及給藥 脊髓損傷組和米諾環素干預組用4%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。在無菌操作下，以第3 胸椎棘突為中心行背部縱行切口。于第3 胸椎椎骨節段行椎板切開術。在第3～4 胸椎節段脊髓交界處剪開硬脊膜和軟脊膜，用手術刀切斷脊髓，造成脊髓完全橫斷性損傷；術中注意保留脊髓后靜脈、兩側的脊髓后動脈和脊髓前動脈，保證脊髓下段的血液供應［6-7］。建模成功大鼠肌張力消失同時出現損傷平面以下各種反射消失。假手術組與脊髓損傷組手術步驟一致，但暴露脊髓后不進行橫斷，僅行椎板切除術。

1.4 病理學取材及觀察 術后第22 天，所有大鼠全身灌流固定后取損傷區脊髓及其上下部分。其中18例標本（每組6例）進行梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，5 μm 連續橫切片。HE染色觀察脊髓組織病理形態學變化。

1.5 Western blot檢測脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達 術后第22 天，處死剩余大鼠，快速取出胸3～4 節段脊髓組織約100 mg，放入1.5 mL 離心管，在冰上將組織剪碎。加入蛋白裂解液1 mL 勻漿，12 000 r/min 離心15 min，取上清。蛋白定量后按照4∶1 加入5×SDS buffer，95 ℃煮沸5 min變性，迅速冰浴，-80 ℃保存。每孔上樣30μg蛋白行十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；PVDF轉膜（轉膜條件：電流100 mA，濕轉30 min）。5%脫脂奶粉封閉，分別加入一抗兔抗Bcl-2 多克隆抗體（1∶1 000）、兔抗Bax 單克隆抗體（1∶2 000）、兔抗Caspase-3多克隆抗體（1∶1 000）或β-actin 抗體于4 ℃過夜；洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h；洗膜，發光，顯色劑顯影，X 射線膠片定影。掃描后應用Image Pro Plus 6.0 軟件分析目的條帶的灰度值，以目的條帶和βactin條帶的積分光密度（IOD）比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.6 免疫組化染色觀察Bcl-2、Bax 和Caspase-3的表達 術后第22天，所有大鼠全身灌流固定后取損傷區脊髓及其上下部分。每組取6例標本進行梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋后5μm連續切片。檸檬酸鈉溶液進行熱修復，3%H2O2封閉，加山羊血清室溫孵育，分別滴加一抗兔抗Bcl-2多克隆抗體（1∶200）、兔抗Bax單克隆抗體（1∶250）、兔抗Caspase-3多克隆抗體（1∶500）4 ℃過夜，陰性對照以PBS代替一抗。PBS沖洗后滴加二抗，37 ℃孵育10 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵蛋白工作液37 ℃孵育10 min。DAB顯色，常規蘇木素復染。每張切片隨機選取5個不重復視野，計算陽性細胞數，取平均值。

1.7 Hoechst 染色法檢測細胞凋亡 將上述組織切片經過二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟、梯度乙醇脫水，PBS清洗2次，每次3 min，吸盡液體；加入0.5 mL Hoechst 33342 工作液，于搖床上避光染色5 min；PBS 搖洗2遍，去染液，每次3 min，50%甘油緩沖液封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，細胞核明顯固縮，呈碎塊狀致密濃染的為凋亡細胞，正常細胞核呈現藍色。在200倍鏡下每組取5個視野計數凋亡細胞數，取平均數。

1.8 免疫熒光檢測脊髓組織中Ngb 熒光強度 將石蠟切片常規脫蠟、脫水，PBS 搖洗，用0.25%Trion X 100室溫處理30 min，PBS 搖洗3 次，將切片放入檸檬酸緩沖液（95～98 ℃）中20 min 進行抗原修復，待恢復至室溫后取出切片，PBS浸泡5 min。滴加10%山羊血清室溫封閉切片60 min。滴加30μL鼠抗Ngb IgG 多克隆抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜。次日取出，室溫放置30 min 后用PBS 搖洗。避光滴加山羊抗鼠-594 IgG熒光二抗30μL（1∶200），孵育60 min，PBS搖洗3次。封片劑封片，蓋玻片四周涂指甲油封固，4 ℃避光保存。在高倍視野下隨機選取5 個互不重疊的區域拍攝照片，利用Image Pro Plus 6.0分析各組圖像中Ngb的免疫熒光強度。

1.9 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件分析，符合正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示。2組間均數的比較采用獨立樣本t 檢驗；多樣本均數的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理形態學觀察及分析 假手術組脊髓組織結構正常，脊髓損傷組脊髓組織正常結構消失，灰質可見有較大空腔，膠質細胞增生明顯，白質區出現數量不等的微囊；米諾環素干預組脊髓組織結構較清晰，空腔體積減小，僅輕度膠質細胞增生。米諾環素干預微囊數量和空腔體積均較脊髓損傷組減少，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

Tab.1 Analysis of optical measurement three weeks after operation表1 術后3周光鏡下計量分析（n=6，±s）

Tab.1 Analysis of optical measurement three weeks after operation表1 術后3周光鏡下計量分析（n=6，±s）

＊＊P＜0.05

組別脊髓損傷組米諾環素干預組t微囊（個/視野）33.50±1.87 18.00±2.53 12.067＊＊空腔（像素點）148.67±14.81 57.50±6.54 13.792＊＊

Fig.1 HE staining of spinal cord tissues in three groups(×200)圖1 各組大鼠脊髓組織HE染色（×200）

2.2 Western blot結果 與假手術組比較，脊髓損傷組脊髓組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達明顯升高；與脊髓損傷組比較，米諾環素干預組大鼠脊髓組織Bcl-2表達明顯升高（P＜0.05），Bax、Caspase-3表達顯著降低（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.2 Western blot analysis of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in three groups圖2 Western blot 檢測各組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的表達

Tab.2 The relative expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 proteins in spinal cord tissues of three groups表2 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達量 （n=6，±s）

Tab.2 The relative expression of Bcl-2,Bax and Caspase-3 proteins in spinal cord tissues of three groups表2 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達量 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與脊髓損傷組比較，P＜0.05

組別假手術組脊髓損傷組米諾環素干預組F Bcl-2 0.96±0.04 1.41±0.12a 1.84±0.09ab 147.831＊＊Bax 0.22±0.04 0.93±0.04a 0.36±0.06ab 337.223＊＊Caspase-3 0.12±0.01 0.46±0.09a 0.34±0.04ab 54.972＊＊

2.3 免疫組化結果 脊髓灰質中Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的免疫反應陽性物質在神經元和神經膠質細胞中均有表達。Bcl-2主要分布在胞質中，著黃色；Bax分布在神經元胞膜和胞質中，呈黃色或棕黃色；Caspase-3 分布在脊髓前角運動神經元胞質、胞核和突起中，呈黃色或棕黃色。與假手術組相比，脊髓損傷組Bcl-2、Bax 和Caspase-3 陽性細胞均明顯增多且著色較深；而與脊髓損傷組相比，米諾環素干預組Bcl-2陽性細胞數較脊髓損傷組增加更為明顯（P＜0.05），而Bax 陽性細胞和Caspase-3 陽性細胞較脊髓損傷組有所減少（P＜0.05）。見圖3、表3。

2.4 細胞凋亡檢測結果 熒光顯微鏡下可見假手術組幾乎沒有凋亡細胞，脊髓損傷組凋亡細胞數明顯高于假手術組，米諾環素干預組凋亡細胞數較脊髓損傷組有所減少（P＜0.05）。見圖4、表4。

2.5 3組Ngb免疫熒光染色結果 在大鼠脊髓組織中Ngb陽性細胞表達紅色熒光。假手術組Ngb呈少量的胞質表達，熒光強度較低；脊髓損傷組Ngb的表達有所增強，熒光強度較假手術組增加；而米諾環素干預組Ngb的熒光強度較脊髓損傷組顯著增強。見圖5、表4。

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Bax and Caspase-3 positive cells in spinal cord tissue between three groups表3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3陽性細胞的比較（n=6，個/視野，±s）

Tab.3 Comparison of Bcl-2,Bax and Caspase-3 positive cells in spinal cord tissue between three groups表3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax和Caspase-3陽性細胞的比較（n=6，個/視野，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與脊髓損傷組比較，P＜0.05

組別假手術組脊髓損傷組米諾環素干預組F Bcl-2陽性細胞5.00±0.63 32.83±3.00a 59.50±1.76ab 1 038.977＊＊Bax陽性細胞1.00±0.63 76.33±2.42a 53.00±2.10ab 2 509.750＊＊Caspase-3陽性細胞2.33±1.21 50.33±3.14a 32.83±2.32ab 636.018＊＊

Tab.4 Comparison of the number of apoptotic cells and the fluorescence intensity of Ngb positive cells between three groups表4 各組大鼠凋亡細胞個數及Ngb陽性細胞熒光強度的比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of the number of apoptotic cells and the fluorescence intensity of Ngb positive cells between three groups表4 各組大鼠凋亡細胞個數及Ngb陽性細胞熒光強度的比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與脊髓損傷組比較，P＜0.05

組別假手術組脊髓損傷組米諾環素干預組F凋亡細胞數（個/視野）0.50±0.55 19.33±2.16a 14.83±2.04ab 190.639＊＊Ngb免疫陽性細胞熒光強度0.60±0.03 1.10±0.05a 1.31±0.06ab 315.291＊＊

Fig.3 Immunohistochemical results of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in three groups of rats(×400)圖3 各組大鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3免疫組化結果（×400）

Fig.4 Results of apoptotic staining in three groups of rats(Immunofluorescence stainning，×200)圖4 各組大鼠細胞凋亡染色結果（免疫熒光染色，×200）

Fig.5 Results of immunofluorescence staining of Ngb protein in three groups(×400)圖5 各組Ngb免疫熒光染色結果（×400）

3 討論

脊髓損傷是一種高致殘率的嚴重創傷，包括原發性損傷和繼發性改變。脊髓功能喪失主要是由繼發改變引起的，在損傷急性期通過減輕或消除繼發性病理變化、保護殘存的軸突和神經元不再遭受二次損傷，是目前關于脊髓損傷藥物治療研究的重點。原發性損傷為不可逆改變，故治療脊髓損傷主要應防止脊髓的繼發性損傷。脊髓繼發性損傷的主要病理變化是神經細胞死亡，發生在脊髓損傷后急性期，以細胞腫脹破裂為主要形式；細胞凋亡是脊髓損傷后神經細胞死亡的主要方式，主要是由內源性內切酶的激活而導致的程序性細胞死亡，是由多基因調控的細胞主動死亡過程。脊髓損傷主要是由損傷后水腫的發展，激發一系列的分子和細胞機制，引發炎癥反應等，最終導致細胞的凋亡和壞死［9］。脊髓損傷后給予米諾環素可以調節半胱天冬酶的活性，抑制Caspase-1 和Caspase-3 的激活，減少細胞凋亡［10］。Festoff等［11］也報道米諾環素對脊髓損傷的治療作用，研究結果顯示米諾環素可以調節小膠質細胞的活性，減少神經細胞凋亡。

有研究表明，Bcl-2、Bax 蛋白和Caspase-3 在脊髓損傷后神經細胞的凋亡中具有非常重要的參考價值［12］。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制或有效阻止脊髓損傷后各種途徑引起的細胞凋亡，促進損傷神經組織的修復［13］。Bax蛋白位于細胞質的線粒體內，脊髓損傷后可刺激Bax 蛋白使線粒體膜的通透性發生變化，誘導神經細胞凋亡。Bcl-2和Bax蛋白的表達水平直接影響脊髓神經細胞的凋亡，且凋亡的程度和Bcl-2/Bax呈正相關［14］。Caspase-3是凋亡的“分子開關”，控制著凋亡的啟動，其活性一定程度上可反應脊髓損傷部位細胞凋亡的狀況［15］。因此，本實驗通過檢測Bcl-2、Bax 和Caspase-3 的表達情況，觀察米諾環素干預對損傷脊髓組織凋亡蛋白的影響。研究結果發現，米諾環素干預組大鼠脊髓組織Bcl-2蛋白的表達明顯高于脊髓損傷組，同時Bax蛋白和Caspase-3 蛋白的表達在對應時間明顯低于脊髓損傷組。表明預防性應用米諾環素可使脊髓損傷大鼠Bcl-2 蛋白表達上調，Bax 和Caspase-3 的蛋白表達下調，因而有效抑制了神經細胞的凋亡。

Ngb 蛋白是Burmester 等［16］于2000年首次在中樞神經系統內發現的一種脊椎動物攜氧球蛋白，有助于轉運氧通過血腦屏障和血脊屏障，從而提高中樞神經系統氧的利用率。目前在中樞神經系統損傷及缺血的研究方面有較多報道。于如同等［17］研究了神經紅蛋白在脊髓中的表達與分布情況，發現Ngb位于神經元的胞質中，主要集中在脊髓前角運動神經元。其功能可能在于促進氧向神經元線粒體的擴散，供給線粒體能量。因此，Ngb能增加神經細胞的氧供應，提高神經細胞的功能和存活率。孔令勝等［18］在研究神經干細胞移植對脊髓損傷后神經紅蛋白的影響時發現脊髓損傷組大鼠脊髓在損傷后Ngb陽性神經元數目、光密度值較正常組增加，神經干細胞移植組大鼠Ngb免疫陽性的神經元染色強度逐漸增加，在損傷后第14 天達到最高值，表達高峰較脊髓損傷組明顯延長，經胚胎干細胞移植后能明顯上調Ngb的表達。

本研究發現，米諾環素干預脊髓橫斷損傷大鼠后，米諾環素干預組Ngb 的平均熒光強度較脊髓損傷組明顯增強。Ngb 的免疫熒光結果同脊髓組織Hoechst 染色檢測細胞凋亡的結果相對應。米諾環素干預組的凋亡細胞數較脊髓損傷組明顯減少。因此，米諾環素能上調Ngb的表達，進而減少脊髓損傷后神經細胞的凋亡，具體的調控機制尚需進一步深入研究。臨床上甲潑尼龍具有神經保護作用，其治療脊髓損傷有最佳的時間窗［19］。而米諾環素應用于脊髓損傷是否有時間窗，需要進一步的實驗研究，期望米諾環素能從多方位、多靶點對脊髓損傷患者進行有效的防治。