Klotho蛋白在糖尿病腎病中的研究進展

王嵐，鄒新蓉，王小琴

(1.湖北中醫藥大學第一臨床學院，武漢 430061；2.湖北省中醫院，湖北省中醫藥研究院)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，也是終末期腎衰竭的主要致病因素。據預測，至2030年，全球范圍內20～79歲的人口中將有7.7%罹患糖尿病[1]，與之伴隨的，將是DN發病率的逐年上升。糖尿病腎病是多因素作用下的一種復雜疾病，其確切發病機制尚未闡明。其中，氧化應激、血管鈣化、內皮功能紊亂、腎臟纖維化等是加劇DN發生發展的重要病理基礎。Klotho作為一種抗衰老基因于1997年首次發現[2]，全長約50 kb，由5個外顯子和4個內含子組成。Klotho主要在遠端腎小管及腦脈絡叢表達，少量表達于甲狀旁腺、前列腺、胎盤等組織。迄今為止，發現Klotho家族包含α-Klotho，β-Klotho及γ-klotho三種蛋白。Klotho基因編碼的蛋白具有抗炎性反應、抗氧化應激、抗細胞凋亡、抗纖維化、抗腫瘤等多種生物學效應。近年來相繼有研究報道，Klotho在多種急、慢性腎臟疾病如急性腎損傷、缺血性腎病、高血壓腎損害、多囊腎、腎小球腎炎、糖尿病腎病中發揮腎臟保護作用[3-7]，其中，Klotho 與糖尿病腎病的發生發展關系密切，業已成為研究的熱點，現綜述如下。

1 Klotho蛋白與糖尿病腎病氧化應激

氧化應激是孕育糖尿病微血管并發癥的共同土壤，亦是激活DN相關信號通路的關鍵介質之一。在高糖刺激下，增強的氧化應激不僅能誘導足細胞和內皮細胞的凋亡，還能直接發起攻擊，導致細胞損傷[8-9]。同時，氧化應激是活性氧(ROS)與抗氧化劑之間平衡被打破時的表現，而糖尿病是一類以ROS生成過多為特征的疾病，并由此導致三磷酸腺苷(ATP)高表達及腺呤能受體P2X7的激活，從而引發細胞死亡[10]。Menzies等[11]研究發現，糖尿病患者相較于對照組，腎組織標本中的P2X7表達增多；并通過動物實驗證明P2X7抑制劑能夠減輕DN小鼠的腎臟損害。可見，在高血糖刺激下，腎臟P2X7的激活參與了DN進程。而近來有研究表明，在糖尿病大鼠模型中，腎臟Klotho的表達于P2X7呈負相關，且隨著病情的加劇，腎功能及氧化還原平衡參數出現改變時，仍維持負相關。因此，Klotho與P2X7在DN進程中存在拮抗作用錳超氧化物歧化酶(MnSOD)可以清除體內有害的氧自由基，具有抗氧化的作用。有研究報道：叉頭轉錄因子O3a(FoxO3a)具有提高MnSOD表達的生物學效應[12]，因此FoxO3a可對線粒體ROS的生成起到負調控的作用，從而拮抗氧化應激[13]。Lim等[14]研究表明，Klotho能夠抑制FoxO3a的磷酸化，使得FoxO3a與MnSOD啟動子區域結合增強，揭示Klotho可能通過FoxO3a介導的MnSOD抑制ROS相關的氧化應激。Liu等[15]在體外實驗中觀察到AGEs可呈劑量依賴性的增強氧化應激并降低近端小管上皮細胞Klotho的表達；成功質粒轉染后，Klotho的過表達可顯著改善AGEs誘導的小管損傷標志物的產生及細胞凋亡。提示Klotho可能通過抗氧化應激發揮小管間質的保護作用。

由此可見，Klotho可通過阻斷P2X7，調節FoxO3a、AGEs因子等多種途徑抗氧化應激，發揮腎臟保護作用。

2 Klotho蛋白與糖尿病腎病血管鈣化

血管鈣化是高血壓、糖尿病、慢性腎臟病、動脈粥樣硬化等多種疾病普遍存在的病理特點。既與鈣磷代謝紊亂，鈣鹽沉積于動脈壁有關；又與骨的礦化作用類似，是一種細胞介導的可調控的過程，其中以血管平滑肌細胞(VSMC)向成骨樣細胞表型轉變最為常見。而DN在雙重危險因素作用下，血管鈣化愈發明顯，導致患者致殘率及死亡風險升高。Klotho基因敲除小鼠在4周齡時即可出現動脈硬化，并持續加重，表現動脈廣泛鈣化，而予以外源性Klotho干預后，血管病變得以明顯改善[2]。Hum等[16]發現，通過腺相關病毒介導的Klotho基因轉導能夠降低DN小鼠的血磷水平。Jono等[17]報道，Klotho的高表達能夠有效抑制高磷誘導下的VSMC向成骨細胞轉分化。進一步研究發現，在尿毒癥環境下，VSMC上的Ⅲ型鈉磷協同轉運體中的亞型Pit-1活性增強，表達升高，Pit-1可促進磷的吸收，從而引發血管鈣化。而當Klotho過表達時，Pit-1水平下降，成骨細胞轉錄因子2表達減少；提示Klotho可能通過抑制VSMC對磷的吸收，防止VSMC向成骨細胞表型轉變，從而減輕血管鈣化[18]。成纖維細胞生長因子-23(FGF-23)是體內重要的調磷因子，Klotho作為FGF23與FGFR結合所必須的輔助因子，協同FGF23調節鈣磷代謝。在DN患者的血漿及腎臟中，Klotho表達下降，隨著病情加劇，腎臟分泌的Klotho顯著減少，由此引發機體對FGF23的抵抗狀態，導致血磷升高，繼發性甲狀旁腺功能亢進，維生素D缺乏等一系列代謝紊亂的局面，最終將導致血管鈣化[19-23]。

以上證據表明，Klotho可能通過參與調節鈣磷代謝，抑制VSMC向成骨細胞轉分化得以防治DN血管鈣化。

3 Klotho與糖尿病腎病內皮功能紊亂

血管內皮功能紊亂與DN 的發生發展密切相關。廣泛的內皮損傷是糖尿病微血管并發癥的重要危險因素之一。生理狀態下，血管內皮生長因子(VEGF)能夠調節血管通透性，促進血管新生并維持血管功能。Klotho基因缺陷小鼠表現出VEGF介導的血管生成受損及血管通透性升高[24]。近來有報道稱Klotho蛋白可通過直接與VEGF受體2(VEGFR-2)及瞬時受體電位通道1(TPRC-1)相結合，增強VEGFR-2與TRPC-1之間的相互作用，從而調節VEGFR/TRPC-1介導的Ca2+內流，發揮維持血管內皮生物穩態的作用[24]。相反，Klotho缺乏將引發Ca2+內流持續增強和Ca2+依賴型蛋白酶的過度活化，促使血管損傷，血管通透性升高。可見，Klotho可能通過調節VEGF的表達參與血管病變的病理過程[25]。可調節腎小球血管壁通透性，發揮血管保護作用[26-27]。Kadoya等[28]報道，在早期糖尿病腎病Akita小鼠模型中可觀察到內皮細胞糖萼缺失、腎小球巨噬細胞浸潤、腎小球肥大、系膜擴張等病理特征，而在Klotho轉基因-Akita小鼠模型中，Klotho的過表達使以上病理損傷得以緩解。鈣蛋白酶的激活與腎小球巨噬細胞浸潤關系密切。有研究表明，抑制鈣蛋白酶的活性可以減少高糖環境下的內皮細胞表面促炎癥黏附分子的表達[29]。而Kadoya等在細胞培養時，進一步發現，Klotho能夠抑制高糖誘導下的鈣蛋白酶激活。Manya等[30]在Klotho基因缺陷的小鼠腎臟中觀察到μ-鈣蛋白酶的激活，說明Klotho蛋白可以抑制μ-鈣蛋白酶的活化。

因此，Klotho可能是一種血管保護蛋白，通過調節VEGF的表達，維持內皮的的生理結構，降低內皮細胞的炎性反應和拮抗鈣蛋白酶的活性等途徑，改善內皮功能，發揮DN的保護作用。

4 Klotho蛋白與糖尿病腎病腎臟纖維化

轉化生長因子-β1(TGF-β1)信號通路的激活可引發DN腎臟纖維化[31]。有研究報道[32]，在Klotho基因缺陷小鼠腎臟中，TGFβ1的下游因子Smad2磷酸化水平增強，說明Klotho基因缺陷可能通過激活TGFβ1/Smad2信號通路，加劇早期DN。提示Klotho蛋白可通過拮抗TGFβ1，發揮在DN中的抗纖維化作用。目前認為，在DN狀態下，Wnt/β-catenin信號通路的激活參與了足細胞功能失調，系膜細胞凋亡，小管上皮細胞間質轉分化的進程，從而與DN纖維化密切相關[33]。Zhou等[34]研究表明，無論在Akita、db/db小鼠還是鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠腎組織中，均可出現Wnt、β-catenin蛋白表達上調。進一步在Akita糖尿病小鼠模型中觀察到，Wnt信號通路的激活可導致多種促纖維化因子的過度生成，而予以Wnt信號通路阻斷劑干預后，Akita糖尿病小鼠腎臟的纖維化、炎癥狀態得以顯著改善。有學者在單側輸尿管梗阻及阿霉素誘導的腎臟纖維化小鼠模型中發現，β-catenin的活化與Klotho蛋白表達減少關系密切，且在體外實驗中發現，Klotho能夠與Wnt1、Wnt4和 Wnt7a等多種配體相結合，從而抑制Wnt信號通路的激活。證明了Klotho是Wnt/β-catenin信號通路的內源性阻斷劑[35]。而在本課題組的前期研究中，同樣證明了Klotho與Wnt/β-catenin的負向調控關系。在STZ誘導的DN小鼠腎組織中Klotho蛋白表達較健康對照組明顯下降，Wnt、β-catenin蛋白表達顯著上調；而中藥治療組DN小鼠中，Klotho蛋白表達較模型組明顯增加，而Wnt、β-catenin蛋白表達水平則相反[36]。亦有學者在單側腎切除的糖尿病小鼠中發現，經重組Klotho干預后，腎小球肥大及促纖維化指標均明顯下調[37]。

以上種種證據表明，Klotho通過參與調控TGF-β1、Wnt信號通路等多種途徑拮抗DN纖維化的進程，發揮腎臟的保護作用。

5 小結

現階段臨床上針對糖尿病腎病所導致的高致殘率、高死亡率，尚無確切有效的治療方案，尋找新的治療靶點，將具有重要意義。Klotho作為一種抗衰老蛋白，可通過抗氧化應激、抑制血管鈣化、調節內皮功能、拮抗腎臟纖維化等多種途徑保護腎臟，有望成為糖尿病腎病新的治療靶點。