花生黑腐病菌碳水化合水解酶的全基因組分析

陳欣瑜 周荃 羅梅

摘要：花生黑腐病（Cylindrocladium black rot of peanut，簡稱CBR）是由寄生帚梗柱孢霉（Cylindrocladium parasiticum Crous，Wingfield & Alfenas）侵染引起的一種嚴重的檢疫性病害，給農業生產造成了巨大的經濟損失。以筆者所在實驗室前期獲得的花生黑腐病菌全基因組18 366個蛋白序列為基礎，利用CAZymes Analysis Toolkit預測程序進行注釋，共獲得注釋碳水化合水解酶（CAZymes）1 197個，分為6個家族，分別為191個輔助酶（auxiliary activities，簡稱AAs）、137個糖基轉移酶（glycosyl transferases，簡稱GTs）、422個糖苷水解酶（glycoside hydrolases，簡稱GHs）、48個多糖裂解酶（polysaccharide lyases，簡稱PLs）、300個碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，簡稱Ces）、99個碳水化合物綁定結構（carbohydrate-binding modules，簡稱CBMs）。根據Blast2GO對花生黑腐病菌CAZymes蛋白的功能分析結果，將CAZymes分為3大類分別為生物進程、細胞成分、分子功能類。該研究可為進一步解析CAZymes的功能奠定基礎，為深入研究該致病菌侵染植物的作用機制提供了一定的理論依據。

關鍵詞：花生黑腐病菌;寄生帚梗柱孢霉;水化合水解酶;全基因組;分析

中圖分類號： S435.652 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0052-04

花生黑腐病（Cylindrocladium black rot of peanut，簡稱CBR），別稱圓錐黑斑病或大豆紅頂腐爛病，是一種由寄生帚梗柱孢霉（Cylindrocladium parasiticum Crous，Wingfield & Alfenas）侵染引起的真菌性病害[1-2]。該病害最早于1965年在美國喬治亞州的花生產區被發現[1]，目前已蔓延到美國東南部、日本、印度及澳大利亞的花生產區[1-4]。該病害可侵染花生的果針、莢果和根系，罹病部位變黑腐爛，并導致植株萎蔫和死亡，是一種毀滅性的病害[5]。由于其潛在危險性，我國于2007年將寄生帚梗柱孢霉列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中[6-7]。花生黑腐病是一種典型的土傳和種傳病害。其中，種子傳播是病害迅速蔓延的最主要原因，這也加大了其防治難度。農業防治采取3～5年輪作的防治方法，該方法僅能控制微小菌核數量，不能有效控制病害的發生;化學防治方面，目前沒有有效的殺菌劑可以使用;在發病嚴重區域，土壤熏蒸可起到一定作用，但是費用昂貴[7-8]。目前，我國對花生黑腐病病害防治的主要方法是培養抗性品種，但目前還沒有培育出高抗品種，只有一些中抗的花生品種[9]。因此，從分子生物學角度進一步研究花生黑腐病菌致病機制對于該病的防治具有重要意義。

碳水化合水解酶類（carbohydrate active enzymes，簡稱CAZymes）在病原真菌的致病過程中具有重要的作用。病原真菌分泌的碳水化合水解酶參與了侵染寄主植株的過程，是植物病原菌侵染過程中突破寄主細胞第1道屏障的關鍵因素。碳水化合水解酶類尤其是植物細胞壁降解酶對病原菌的侵染能力和特性具有重要作用[10-11]。近年來，隨著越來越多病原菌全基因組測序的完成，CAZymes的注釋和比較分析成為了重要的研究方向[12]。近年來，碳水化合物結構與功能活性酶類（carbohydrate-active enzymes database，簡稱CAZy）數據庫的建立[13]極大地推進了國內外學者對于植物病原菌細胞壁降解酶活性基因的注釋與聚類分析工作。目前CAZymes主要分為6大類分別為輔助酶類家族（auxiliary activities，簡稱AAs）、糖基轉移酶（glycosyl transferases，簡稱GTs）、糖苷水解酶（glycoside hydrolases，簡稱GHs）、多糖裂解酶（polysaccharide lyases，簡稱PLs）、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，簡稱CEs）、碳水化合物綁定結構家族（carbohydrate-binding modules，簡稱CBMs）[14]。目前，已經有多種病原菌的CAZymes得到分析[10，15-16]。但是迄今為止，對帚梗柱孢霉CAZymes的分析仍未見報道。筆者所在實驗室前期測定并組裝了花生黑腐病菌Cylpar14017菌株的全基因組序列，本研究在此基礎上利用生物信息學手段對其CAZymes進行注釋分析，揭示CAZymes家族的分類情況，以期為今后深入開展其CAZymes的功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因組數據來源

本研究分析所用基因組數據來源于仲愷農業工程學院植物病理學研究所前期測序獲得的花生黑腐病菌Cylpar14017菌株的全基因組拼接序列，共包含18 366個蛋白序列。

1.2 方法

CAT（CAZymes Analysis Toolkit，http：//cricket.ornl.gov/cgi-bin/cat.cgi）數據包是專門用于CAZymes注釋和分析的程序[14]。基于dbCAN數據庫，用Hmmer 3.0搜索CAZymes的編碼基因，采用hmmscan-parser和all.hmm.ps.len進行處理，然后通過CAT程序進行CAZymes比對預測，獲得花生黑腐病菌的CAZymes蛋白。用Blast2GO分析花生黑腐病菌CAZymes蛋白，結合WEGO整理分析結果。

2 結果與分析

2.1 花生黑腐病菌CAZymes總體分布

將“1.1”節中獲得的18 366個序列和CAT數據包進行比對，共有 1 114 個蛋白序列，獲得注釋水解酶家族總數為1 197個。其中CBM為99個、CE為300個、GH為422個、GT為137個、PL為48個、AA為191個。GHs含量最高，占總數的35%，CEs、AAs、GTs、CBMs、PLs分別占總數的25%、16%、11%、8%、4%（圖1）。而CBM的99個基因歸類于22個基因家族;CE的300個基因歸類為12個基因家族;GH的422個基因歸類在64個基因家族;GT的137個基因歸類為37個基因家族;PL則為8個家族，而AA的191個基因歸類于9個家族中。

2.2 花生黑腐病菌中含有的GHs

根據糖苷水解酶數據進行分析結果（圖2）顯示GH109數量最多，為52個，緊隨其后為GH3，為48個，同時GH16、GH18、GH28、GH31、GH43、GH47、GH5、GH76、GH78數量較多，均超過了10個。該類別為六大水解酶類中亞家族數最多的類別，共有64個亞家族類別。

2.3 花生黑腐病菌中含有的GTs

根據糖基轉移酶數據進行分析結果（圖3）發現，GT2數量遠遠多于其他亞家族，為31個，約占GTs總數量的23%。其次，GT1和GT32的數量也較多，都為13個。除此之外，還含有GT4、GT64、GT90等34類蛋白。該類別為六大水解酶類中亞家族數第2多的類別。

2.4 花生黑腐病菌中含有的CBMs

根據碳水化合物綁定結構家族數據進行分析結果（圖4）表明，數量最多的蛋白類別為CBM50，為20個，約占CBMs總數的20%，其次是CBM1，約占CBMs總數的15%。除此之外，還含有CBM18、CBM67、CBM24等20類蛋白。

2.5 花生黑腐病菌中含有的CEs

根據碳水化合物酯酶數據進行分析結果（圖5）發現，CE10數量遠遠多于其他亞家族，為164個，約占CEs總數量的55%。其次，CE1數量較多，為51個。除此之外，還含有CE4、CE5、CE8、CE16等10類蛋白。

2.6 花生黑腐病菌中含有的AAs

根據輔助酶類家族數據進行分析結果（圖6）發現，數量最多的蛋白類別為AA7，為82個，約占AAs總數的43%，其次是AA3，約占AAs總數的26%。除此之外，還含有AA1、AA2、AA4、AA9等7類蛋白。

2.7 花生黑腐病菌中含有的PLs

根據多糖裂解酶數據進行分析結果（圖7）發現，數量最多的蛋白類別為PL1，為20個，約占PLs總數的42%，其次是PL3，約占總數的27%。除此之外，還含有PL22、PL4、PL9等6類蛋白。該類別為6大水解酶類中亞家族數最少的類別。

2.8 花生黑腐菌CAZymes蛋白Blast2GO分析結果

根據Blast2GO對花生黑腐病菌CAZymes蛋白的功能分析結果，將CAZymes分為三大類，分別為生物進程、細胞成分、分子功能類（圖8）。在生物進程大類中數量最多的為代謝進程類，為311個，約占生物進程大類總數的69%， 除此之外，還含有未進化、細胞生源或組織成分、細胞進程、生物調節進程、刺激反應、生物調節、信號命令、排毒等8小類。在細胞成分大類中數量最多的為細胞外區域類，為58個，約占細胞成分大類總數的33%，除此之外，還含有細胞部分、細胞器部分、細胞膜、大分子復合物、細胞器、細胞膜部分、細胞外區域部分等7小類。在分子功能大類中數量最多的為催化活性類，為426個，約占分子功能大類總數的73%，除此之外，還含有聯結、轉錄活性調節劑、轉運活性、抗氧化活性、營養儲存活性等5小類。

3 結論與討論

隨著大量真菌基因組測序的完成，先后有人利用基因組信息開展CAZymes家族的預測分析。韓長志等分析了黏綠木霉（Trichoderma virens）Gv29-8的377個分泌蛋白，并進行進一步的CAZymes家族分析，共得到201個CAZymes[16]。本研究并未對花生黑腐病菌Cylpar 14017全基因組進行分泌蛋白的篩選，共有1 114個花生黑腐病菌蛋白序列獲得注釋，得到的水解酶家族總數為1 197個。通過分析可知，所得的CAZymes里包含有大量的非分泌蛋白。

本研究分析得到在花生黑腐病菌CAZymes家族類別中，GHs含量最高，占總數的35%;其次是CEs、AAs為16%、GTs、CBMs，分別占總數的25%、16%、12%、8%，PLs的含量最少，只有4%。GH在大多數真菌CAZymes里的含量通常最高。韓長志等通過分析了黏綠木霉Gv29-8的分泌蛋白發現，GHs在CAZymes中含量最多，占了46.27%[16]。韓長志分析的禾谷炭疽菌[Colletotrichum graminicola（Cesati） Wilson]中也是GH最高，占33.33%[18]。而其他種類往往有所差異，在本研究中，CE總數僅次于GH，CBM的數量僅為總數的8%。而在黏綠木霉Gv29-8菌株中CBM占了 25.87%，CE數量較少。在禾谷炭疽菌中CBM為總數的 19.85%，GT數量占總數的0.75%[16-17]。這種數量上的差異可能是因為花生黑腐病菌和黏綠木霉、禾谷炭疽菌等病原菌遺傳背景存在差異，也可能是因為這些病原菌的寄主植物不同，對寄主植物致病所需產生的水解酶家族和數量也會有不同。

在真菌CAZymes家族中往往都存在著復合類別。本研究中共有1 114個花生黑腐病菌蛋白序列獲得注釋，得到的水解酶家族總數為1 197個。其中部分單個蛋白序列會獲得1個或多個蛋白注釋，稱之為復合型。韓長志等研究發現，在多個真菌的基因組中均存在著此類現象。黏綠木霉Gv29-8中發現了4個CBM35/GH27，包括2個CE4/CBM18、1個GH18/CBM1、1個GH7/CBM1。而禾谷炭疽菌中則發現了30個GH/CBM、10個AA/CBM、1個CE/CBM等。同一蛋白具有復合型酶注釋功能，推測此類蛋白在發揮功能方面具有復合性。

植物病原真菌通過產生大量的CAZymes來降解植物的多糖類物質，以利于其對植物的侵染并獲取其自身所需的營養[18]。本研究通過大規模數據處理的方法，對其進行CAZymes注釋和比較分析。本研究可為花生黑腐病菌的致病因子研究提供材料和基礎，且為其他植物病原真菌CAZymes基因家族的分析建立了初步的篩選方法。

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